高效液相色谱法测定沙格列汀中的有关物质
Determination of Related Substances in Saxagliptin by HPLC
李 卉1,2，吴嘉豪2，沈文婧2，占轶鹏2，阎 超1*
(1. 上海交通大学药学院，上海 200240；2. 上海现代制药股份有限公司，上海 200137)
摘要：建立了正相和反相高效液相色谱法分别测定沙格列汀原料药中的6 种有关物质(1 ～ 6)，并对2 种方法进行了方法学验证。结果沙格列汀的有关物质1 ～ 6 在相应的范围内线性关系良好，样品低、中、高水平的回收率为90.0％～108.0％，RSD ≤ 4.0％。有关物质1 ～ 6 的定量限分别为1.00、0.36、0.40、0.40、0.19 和0.20 μg/ml。本法准确可靠，可用于测定沙格列汀中的有关物质。
关键词：沙格列汀；有关物质；高效液相色谱；含量测定
沙格列汀(saxagliptin) 是一种强效选择性二肽基肽酶-4(DPP-4) 抑制剂，可特异性抑制DPP-4，从而延长内源性胰高血糖素样肽-1(GLP-1) 和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP) 的持续作用时间，降低血糖水平。其耐受性良好，对血脂、血压和心率均无影响，无肝脏、胰腺、骨骼肌和肾脏的安全性问题[1]。
沙格列汀制剂商品名为Onglyza，由Bristol-Myers Squibb 和AstraZeneca 公司联合研发，2009年经美国FDA 批准上市，用于治疗2 型糖尿病[2]。其原料标准尚未被各国药典收录，仅有其进口药品注册标准可做参考[ 3]，但该质量标准未对其对映异构体进行控制，因此本研究拟建立正相和反相高效液相色谱法对沙格列汀中的有关物质进行控制。沙格列汀以及其已知有关物质的化学结构见图1，文献报道了其制备方法[ 4—6]。其中有关物质1( 结构见图1) 为沙格列汀的对映异构体，参考与沙格列汀作用机制一致的同类产品西格列汀，其专利中以正己烷、甲醇、二乙胺为流动相体系[7]，采用Daicel Chiralpak AD-H 柱检测对映异构体，在此基础上，调整流动相比例，并加入异丙醇，建立NP-HPLC 法进行测定；有关物质2 ～ 6( 结构见图1) 是以进口药品注册标准中的有关物质检测为基础，将流动相中的甲醇更换为乙腈，使用磷酸代替三氟乙酸调节流动相酸碱度，并调整洗脱梯度，建立了RP-HPLC 的色谱条件。同时，本研究根据人用药品注册技术要求国际协调会( ICH) 以及国家食品药品监督管理总局(SFDA) 颁布的相关指导原则[ 8—9]，并参考进口药品注册标准中有关物质的限度标准制定了各有关物质限度。
1 仪器与试药
2 方法与结果
2.1 有关物质1
2.1.1 色谱条件
2.1.2 溶液配制
2.1.3 系统适用性试验
取空白溶剂Ⅰ、1 对照品溶液、系统适用性溶液以及供试品溶液，分别进样，记录色谱图，见图2。有关物质1 的保留时间约为10 min。空白溶剂及供试品溶液中各组分不干扰有关物质1 的测定。沙格列汀和有关物质1 的理论板数为3 747 和7 812，分离度为11.3。
2.1.4 线性试验
精密量取“2.1.2”项下有关物质1 对照品贮备液适量，用溶剂Ⅰ分别稀释，制得1.0、2.0、3.0、20.0、30.0 和40.0 μg/ml 的溶液，分别进样测定，记录色谱图。以1 浓度c 为横坐标，峰面积A 为纵坐标，进行线性回归，得回归方程A=8 075.5c-1 611.8，r=0.999 9。表明1 在1.0 ～ 40.0 μg/ml 范围内线性关系良好。有关物质1 的检测限和定量限为0.50 和1.00 μg/ml。
2.1.5 精密度和回收率试验
取“2.1.2”项下1 对照品溶液，连续进样6次，记录色谱图，计算得1 峰面积的RSD(n=6) 为0.38％。
取“2.1.2”项下1 对照品溶液，其浓度作为100％，分别配制低(50％ )、中(100％ )、高(200％ )浓度的回收率质控溶液。精密称取沙格列汀原料药30 mg，共9 份，各置10 ml 量瓶中，分别用上述浓度的回收率质控溶液溶解并定容，各3 份，摇匀。结合精密度试验结果，按外标法以峰面积计算1 的回收率。结果低、中、高浓度溶液中1 的平均回收率(n=9) 为104.5％，RSD 为2.6％。
2.1.6 稳定性试验
取新鲜配制的供试品溶液，分别在0、2、4、8和12 h 进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液中1 的峰面积未见明显增长，沙格列汀峰面积的RSD为1.7％。表明供试品溶液于室温放置12 h 内稳定。
2.1.7 样品测定
取3 批沙格列汀原料药，按“2.1.2”项下方法配制供试品溶液。精密量取供试品溶液，进样测定。结果显示，沙格列汀原料药中未检出有关物质1。
2.2 有关物质2 ～ 6
2.2.1 色谱条件
色谱柱 Dikma C18 柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相 水∶ 乙腈∶ 磷酸( 90 ∶ 10 ∶ 0.1，A)，水∶乙腈∶磷酸(10 ∶ 90 ∶ 0.1，B)，按表1 进行梯度洗脱；检测波长 215 nm；流速 1.0 ml/min；柱温 40 ℃；进样量 10 μl。
2.2.2 溶液配制
2.2.3 系统适用性试验
取空白溶剂Ⅱ、系统适用性溶液以及供试品溶液，分别进样，记录色谱图，见图3。沙格列汀及有关物质2 ～ 6 的保留时间分别为7.3、5.5、6.0、9.8、16.4 和19.7 min。空白溶剂不干扰测定。沙格列汀和有关物质3 的分离度为3.9，理论板数为17 482。
2.2.4 线性试验
取“2.2.2”项下有关物质对照品贮备液以及沙格列汀对照品贮备液，在相当于样品浓度0.02％～2.0％范围内取6 个浓度点，分别制备相应浓度溶液，进样测定，记录色谱图。以峰面积A 为纵坐标，有关物质浓度c 为横坐标，进行线性回归；并采用标准曲线法测定各有关物质的相对校正因子( f)。由于在实际样品检测中，校正因子对样品中有关物质含量的计算影响不明显，最终采用主成分自身对照法测定有关物质含量。同时计算各有关物质的检测限(LOD) 和定量限(LOQ)，结果见表2。
2.2.5 精密度、回收率和重复性试验
精密量取各有关物质对照品贮备液5.0 ml，置100 ml 量瓶中，加溶剂Ⅱ稀释定容，作为有关物质对照品溶液。取样，连续进样6 次，结果有关物质2 ～ 6 峰面积的RSD 分别为0.36％、0.22％、0.39％、0.42％和1.11％。另取LOQ浓度溶液，连续进样6 次，计算得有关物质2 ～ 6 峰面积的RSD 分别为3.0％、1.1％、0.6％、1.4％和5.4％，保留时间的RSD 分别为0.20％、0.06％、0.02％、0.06％和0.08％。分别量取各有关物质对照品贮备液5.0 ml，各置200、100 和50 ml 量瓶中，加溶Ⅱ稀释定容，作为50％、100％和200％浓度水平的有关物质对照品溶液。精密称取沙格列汀原料药10 mg，共9 份，各置10 ml 量瓶中，分别用上述3 个浓度水平的有关物质对照品溶液溶解并定容，各3 份。分别进样，记录色谱图。同时，按上述方法制备100％浓度水平的有关物质对照品溶液，共6 份，分别进样，记录色谱图。采用外标法计算各有关物质含量，并计算回收率，结果见表3。
2.2.6 耐用性试验
分别在柱温±5 ℃、流速±0.1 ml/min 范围内考察微小色谱条件参数变化对于各有关物质分离情况的影响。结果显示，在柱温35 ～ 45 ℃，流速为0.9 ～ 1.1 ml/min 时，各有关物质的分离度满足要求，方法耐用性良好。
2.2.7 样品测定
取3 批沙格列汀原料药，按“2.2.2”项下方法配制供试品溶液以及对照溶液，并分别进样测定。结果显示，沙格列汀原料药中有关物质3 含量分别为0.06％、0.09％和0.08％，有关物质2、4、5、6均未检出。
3 讨论
在有关物质1 的检测中，采用正己烷∶异丙醇∶甲醇体系作为流动相，既保证了1 的有效出峰( 在甲醇中溶解性较好)，又保证了正己烷与甲醇的互溶性。按“2.1.1”项下条件进行略微调整( 包括柱温、流动相比例、流动相流速、检测波长以及二乙胺的加入量)，结果沙格列汀和有关物质1 的分离度均能达到要求。
在稳定性试验期间，观察到在有关物质1 的出峰位置处有1 个0.1％的有关物质峰，根据其归一化含量，推测为有关物质4，在0 d 时未检出，但随着试验时间的延长而增长，且在本研究色谱条件下出峰时间与有关物质1 一致。经试验验证，两者确实在相同保留时间处出峰，影响了样品的准确测定。通过调整本法中的流动相比例，将正己烷∶异丙醇∶甲醇∶二乙胺由70 ∶ 22.5 ∶ 7.5 ∶ 0.1 改为65 ∶ 20 ∶ 15 ∶ 0.1，出峰顺序依次为有关物质1( 相对保留时间RRT 0.52)、有关物质4(RRT0.77) 和沙格列汀，相邻峰之间的分离度为4.5 和7.5
( 图4)。
沙格列汀原料药经酸、碱、氧化、高温、光照破坏，高温、强光条件下未见明显杂质产生，提示沙格列汀稳定性良好；酸、碱条件下，降解产物与沙格列汀的分离度良好，主要降解产物为3 和4；氧化条件下易降解，主要降解产物为3。酸、碱、高温、氧化和光照破坏性试验的样品物料平衡好，均在95.0％～ 106.0％。且在各破坏条件下沙格列汀的纯度角均小于纯度阈值，提示沙格列汀主峰纯度高，无杂质干扰。
在检测有关物质2 ～ 6 时观察到，5、6 在室温下降解严重，取有关物质对照品溶液连续进样6 次，其峰面积的RSD 分别为5.8％和3.9％；将有关物质对照品溶液在低温进样室( 5 ℃ ) 中放置，分别于0、2、4、6、8、12、18 和24 h 进样，5、6 峰面积的RSD 为1.38％和1.48％。因此在检测有关物质2 ～ 6 时，供试品须新鲜配制或保存在低温进样室(5 ℃ ) 中。
作者简介：李 卉(1988—)，女，助理工程师，从事药物分析研究。
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通信联系人：阎 超(1956—)，男，教授，博士生导师，从事电动微分离技术、代谢组学、药物分析等领域。
Tel：021-34205673
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