为什么换「反转录试剂盒」会出现qPCR实验数据Ct值变大呢？因为没有去gDNA...

NIRO科研喵 · 公众号 · · 2025-01-06 07:30

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作者 | NIRO

编辑 | 澹泊研究僧

来源 | NIRO（ID：NIRO-keyanmiao）

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近期，NIRO看了一组关于反转录试剂盒平行测试的实验数据，觉得还是比较有意思的，今天整理了一下给大家分享。在分享这个实验数据前，我们先了解qPCR实验的基本知识点。

我们知道在qPCR实验中， 目的基因和内参基因的Ct值是衡量基因表达水平的重要指标 。Ct值代表了荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数。

图片来源: 网络

目的基因和内参基因的Ct值在什么范围比较合理呢？

(1) 目的基因Ct值合理范围 ， 普遍认可为15-33，最好是18-28之间 。如果说Ct值在14或35还是勉强可以用的，但是需要注意的是若Ct值超过35，虽然数据仍可以使用，但可能会对实验结果的准确性产生影响，导致结果偏差较大。

(2) 内参基因Ct值合理范围， 普遍认为15-25，最好是18-22之间。 要是Ct值在10或22之间也是勉强可以使用，但是内参基因的Ct值过于偏离理想范围，可能会对实验结果可靠性产生影响。需要了解更对qPCR实验可看这几篇文章《 qPCR实验中，除了Ct值，还需要看扩增曲线和溶解曲线吗？》、《 qPCR实验中经常忽略的实验细节？你有被cue了吗？》和《 qPCR实验的Ct值的合理范围（附Ct值过大或过小的解决方法）》。

做平行测试的前后逻辑是这样子的！

有两个公司的反转录试剂盒进行平行对比，某实验室 原使用的 反转录试剂盒为A ，后面 新添反转录试剂盒为B 。刚好最近做促销活动采购了反转录试剂盒B，但是做出来的Ct值结果与反转录试剂盒A相差4-5个Ct。起初不了解是什么原因！

图片来源: 平行实验数据整理

为了寻找原因解决问题，然后就进行平行实验。做完平时实验后发现， 其目的基因Ct值其实都相差不是特别明显，但是内参基因Ct值相差就很明显，但内参基因都是合理范围值内。 这就很令人疑惑了，为什么相差那么多呢？

随后进行讨论/查阅两种试剂说明书发现，其实是 反转录试剂A本身就不具备去基因组 ，进行反转录后获得的cDNA和gDNA，在进行qPCR实验时，gDNA和cDNA同时被扩增，因此导致内参基因的扩增曲线异常，Ct值偏小。

而 反转录试剂B本身含有去基因组成分 ，进行逆转录后已经将gDNA去除，剩余cDNA参与qPCR实验扩增，获得的内参基因Ct值才是正常结果。

这也是为什么反转录试剂A的内参基因Ct值和反转录试剂B的内参基因Ct值差异比较大的原因。 是因为该反转录试剂A本身不具备去基因组成分，然后gDNA和cDNA同时参与了qPCR反应导致的。

图片来源: 某生物公司官网截图

所以，使用反转录试剂盒一定要选择去基因组成分的试剂盒，这样才能获得正确的实验数据。

小结

内参基因在qPCR中通常作为判断样本提取是否成功的标准，以及计算目的基因表达量的基础。 如果样本中存在gDNA污染，那么内参基因的扩增结果会受到影响。主要表现为Ct值偏小或扩增曲线形状不标准，结果不准确。 同时，要保证目的基因和内参基因在合理范围内:

(1) 目的基因Ct值合理范围 ， 普遍认可为15-33。

(2) 内参基因Ct值合理范围， 普遍认为15-25。

此外，做qPCR实验切记一定要去基因组(gDNA)，要不然结果是不可信的，除非你想数据造假~

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作者 | NIRO

来源 | NIRO（ID：NIRO-keyanmiao）

排版 | 澹泊研究僧

图片 | 图虫创意

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