自然杀伤细胞（NK细胞）
是机体重要的免疫细胞，以其独特的特性和功能，逐渐在肿瘤、免疫性疾病等多个疾病的治疗中展露头角，成为一种新型有效的治疗方法。
NK细胞来源广泛，可以从外周血、脐带血、NK-92细胞系、多能干细胞（iPSC和ESC）诱导分化等多种来源获得。不过，无论是哪种来源，体外培养NK细胞都面临着扩增困难、细胞易失活或凋亡等问题。
针对这些问题，本文将以新鲜分离的PBMC为例，深入剖析如何高效扩增并保持NK细胞的高纯度。
PBMC [单个核细胞(1-2×10
7
活细胞)] 、NK扩增试剂盒、NK基础培养基、注射用重组人白介素-2（IL-2）、自体血浆/人血小板裂解液（PLT）、T75细胞培养瓶、T175细胞培养瓶、细胞培养袋、离心管、Z型架、止血钳
✔适用多种来源NK细胞的培养
✔NK扩增效率高(可达10000倍)
✔NK细胞纯度高
1.提前配制
NK完全培养基
：
Day
1-6 NK完全培养基：
NK基础培养基+ IL-2（终浓度 200IU/mL）+
5%
自体血浆
；
Day6之后 NK完全培养基
：
NK基础培养基+ IL-2（终浓度 200IU/mL）+
1%
自体血浆
；
2.将NK完全培养基预热至室温。
1.1 NK扩增试剂A置于37℃水浴锅解冻后转移至生物安全柜内；
1.2将细胞悬液转移至无菌离心管中。
逐滴缓慢
加入
10mL复温的NK基础培养基，边加边摇匀。离心（300×g ，5 min）；
1.3 弃上清，
弹散离心管底部沉淀的细胞。
随后加入适量配置好的NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+
5%
自体血浆/PLT
）重悬细胞。
2.根据计数结果，取适量PBMC [单个核细胞(1-2×10
7
活细胞)] 至50mL离心管中，加入复苏后的NK扩增试剂 A 细胞悬液；
3.随后转移至
T75细胞培养瓶
中混合均匀，标记(日期、细胞信息)，培养箱中静置培养(37℃、5%CO
2
)。
根据细胞悬液颜色或细胞密度添加NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+
5%
自体血浆/PLT
）。
一般补液后细胞密度在1-1.5×10
6
cells /mL
。
1.当补液后总体积大于
50mL
时，转入
T175细胞培养瓶
中继续培养。
2.当补液后总体积大于
200mL
时，转入
细胞培养袋
中继续培养。
Day7取样计数，细胞数量
超过
1×10
8
准备进行二次激活，若
低于1×10
8
可以多培养一天
再二次激活。
1.1 、1.2 同复苏NK扩增试剂A的操作步骤；
1.3 弃上清，
弹散离心管底部沉淀的细胞。
加入适量配置好的NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+
1%
自体血浆/PLT
）重悬细胞。
2.取样计数，将复苏后的NK扩增试剂B细胞悬液加入
T175细胞培养瓶
中混合均匀；
3.根据计数结果，计算并加入对应体积的NK完全培养基（NK基础培养基+IL-2+
1%
自体血浆/PLT
）。
4.标记(日期、细胞信息)，培养箱中静置培养(37℃、5%CO
2
)。
1.1 取注射器空筒放入Z型补液架中，旋下细胞培养袋上的螺纹帽与注射口连接，打开进出管卡扣，将细胞悬液转入细胞培养袋中；
