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沉寂多年,河北科技大学韩春雨再发高分文章,开发出RNA高效追踪新系统!

科研小助手  · 公众号  · 科研  · 2022-01-25 21:13

正文

2016 5 月,来自河北科技大学生物科学与工程学院的韩春雨团队在 Nature Biotechnology 上发表了新的基因编辑技术 NgAgo ,并被媒体以“ 甘坐冷板凳、十年憋大招 ”的故事原型炒作而走红。此后半年,韩春雨个人及其所在大学陆续获得各类名誉和大量经费资助,随后被媒体热捧,称其为“三无”教授但有“诺奖级”发现。然而,自该文发表后就争议不断,后续经过众多研究人员的讨论和验证,最终该文在 2017 8 月被撤稿。
之后河北科技大学也是花费重资成立了 基因编辑研究中心 ,韩春雨团队成功入驻。 2021 年,韩所在的河北科技大学 生物科学与工程学院 更是更名为河北科技大学 食品与生物学院 。然而,目前在学院师资一栏却再也难寻韩的身影,令人唏嘘!
2022 1 21 日,沉寂多年的 韩春雨 团队在 Nucleic Acids Research 杂志 (IF=11.501) 上发表了一篇基于 Cas6 系统的 RNA 追踪技术相关文章,题为“ A Cas6-based RNA tracking platform functioning in a fluorescence-activation mode ”。该文曾以“ Background free tracking of single RNA in living cells using catalytically inactive CasE ”为题发表在预印本网站 bioRvix 上,不过,正式发表的文章与预印本文章已经有很大的不同。
文章解读
RNA 的定位与它们的功能密切相关,为追踪 RNA 在活细胞中的分布而开发的技术极大地推进了 RNA 生物学的研究。最近,荧光蛋白标记的 Cas9 Cas13 在活细胞 RNA 追踪中的创新应用进一步丰富了我们的研究手段。然而, Cas9/Cas13 平台以及广泛使用的 MS2-MCP 技术未能解决高背景噪声问题。
最近有报道称 CRISPR/Cas6 在与 RNA 上的 Cas6 结合位点 (CBS) 相互作用后会表现出构象改变。在此,韩春雨团队利用这一特性,设计了一个基于 CAS6 的开关平台,用于检测体内的靶 RNA 。将 Split-Venus 片段连接到内核糖核酸酶突变的大肠杆菌 Cas6 d Ec Cas6 的两端,从而允许配体 (CBS) 激活 Split-Venus 互补特性。研究人员将该平台命名为基于 Cas6 的荧光互补平台 (Cas6FC) 。在活细胞中, Cas6FC 可以检测到几乎没有背景噪声的靶标 RNA 。此外,只要在感兴趣的 RNA 中标记一份 CBS (29nt) 就能够开启 Cas6FC 荧光,这大大降低了靶标 RNA 构象和定位潜在改变的可能性。总而言之, 韩春雨团队开发了一个新的 RNA 跟踪平台,具有高度的灵敏度和特异性。
目前的活细胞 RNA 跟踪技术 分为两类:荧光富集 (FE) 型和荧光激活 (FA) FE 型平台通常由两个关键组成部分组成:作为报告者或追踪者的荧光蛋白结合 RNA 结合蛋白 (R BP-FP) 和在靶 RNA 上遗传构建的特定 RBP 结合序列 (RBS) FE 型的一个突出例子是 MS2-MCP RNA 跟踪系统。然而, FE 型平台通常具有高背景噪声的弱点。
FA RNA 跟踪 / 成像平台部分解决了这一问题。 FA 型平台是基于双分子荧光互补 (BiFC) 。例如, MCP PCP (一种类似于MCP的RNA结合蛋白) 分别与特定 FP N- C- 端结合,由此产生的两个报告片段 MCP-FPN PCP-FPC ,在被相邻的 MBS PBS (PCP结合位点) 结合在一起之前,不会重建一个功能完整的荧光蛋白。因此, FA 类平台的信噪比有了很大的提高。然而,与 MS2-MCP 系统要求的 12 × MBS 标签相比,更大的 RNA 标签,例如 12 × MBS-PBS (1400nt) ,经常用于当前的 FA 型平台。插入这个大的外源 RNA 序列容易引起诸多问题。
CAS6 I-E CRISPR 复合体的核心成分。它通过识别 CBS (Cas6结合位点) 的特定茎环 RNA 元件来结合和切割 pre-crRNA CBS 的结合诱导 Cas6 的构象改变,导致其 N C 末端并列。 利用这一特性,研究人员将大肠杆菌来源的 Cas6 ( Ec Cas6) 蛋白改造成 FA 型报告基因。催化结构域突变的 Ec Cas6 (d Ec Cas6) 在其 N- 端和 C- 端分别加上蛋白 Venus Venus-N (VN) Venus-C (VC) ,得到的嵌合体 VN-d Ec Cas6-VC 在与目的 RNA 上的 CBS 结合之前是没有荧光的。由于荧光互补是由 Cas6 的变构开关介导的,因此研究人员将该平台命名为基于 Cas6 的荧光互补 (Cas6FC)
为了测试 Cas6 家族的成员被用作 FE RNA 追踪工具的可能性,选择了来源于大肠杆菌 Ec Cas6 Cas6 ,并研究了其在生理温度 (37℃) 下追踪哺乳动物细胞中 RNA 的应用。首先根据之前的研究,研究人员构建了一个无催化活性的 Ec Cas6 突变体 (第20位的H突变为A) ,并将其命名为 d Ec Cas6 dead Ec Cas6
HEK293T 细胞中, Ec Cas6 表达载体的共转染显著降低了 EGFP 荧光强度,而当使用 d Ec Cas6 表达载体时未观察到这种现象






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