我的博士师兄说他没有看不懂的顶刊！我给他看了这篇中山大学48.8分的代谢产物相关的Cell大子刊，他就开始跟我说今天天气不错了。微环境中的微生物，其实也会通过代谢产物，对微环境中的免疫细胞产生影响。今天讲的这篇文章，就是中山大学第一附属医院的三位博士，发表在48.8分的Cancer Cell上的文章。这篇文章就蛮有意思，一种CRC（结直肠癌）中常见的Fn（有核梭杆菌），对于MSS（微卫星稳定）的CRC有着一种促进抗PD1抗体治疗敏感性的功能。让我们来看看他们都做了点什么吧：
由于之前有一项研究表明，Fn的丰度与MSI（微卫星不稳定）的CRC中的TILs（肿瘤浸润淋巴细胞）呈负相关，但与MSS的CRC中的TILs呈正相关。于是他们就提出假设，假设Fn可能在MSS的CRC中，与免疫细胞的相关免疫治疗有一定的关联性（提出假设的前提，是在已有研究的基础上，或者已经有的预实验或生信统计归纳的基础上得到的，不清楚科研的假设，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。通过验证，他们发现肠道中Fn高丰度预示着MSS的CRC患者对抗PD-1治疗的良好反应。而使用Fn高丰度的CRC粪便，进行粪便微生物群移植，则有助于提高对原位MSS的CRC同种异体移植物的无菌小鼠的抗PD-1治疗簇疗效：
接着，他们建立了植入原位HT29（结直肠癌细胞）异种移植物的CD34人源化NOD scidγ小鼠，从而在小鼠中模拟人源的免疫反应。然后对于这些小鼠肠道，使用抗生素清除了微生物，再通过饲喂Fn或PBS的方式，移植入Fn。Fn的饲喂加速了HT29肠癌肿瘤的生长，但在使用了抗PD1治疗后，Fn则增强了抗PD-1治疗的疗效（这其实就是常见的柯霍氏法则的验证，最早的柯霍氏法则也就是通过移除微生物或者移入微生物来进行后期的表型分析的，这里通过清除了所有肠道微生物，再重新引入Fn，更好地解释了Fn在抗PD1治疗过程中的功能，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。IHC验证发现，Fn+抗PD-1治疗抑制了PD1的表达，但增加GZMB和TNF-α的表达。而Fn减轻CD8+TIL的耗竭，通过抑制PD-1+CD8+的VTIL，促进原位MSS的CRC人源化小鼠模型和小鼠免疫模型中的抗PD-1治疗反应：
接着他们就想看看Fn是否能引发全身的CD8+T细胞的免疫反应，因为之前是定植在肠道的，这次MSS的CRC就被做了皮下移植。结果发现，在携带皮下MSS的CRC异种移植物的无菌免疫人化小鼠和携带原位MSS的CRC同种异体移植物的SPF小鼠中，Fn通过系统激活CD8+TILs来促进抗PD-1疗效。简单来说，就是无菌CD34人源化小鼠中的Fn，可以促进全身性CD8+T细胞介导的抗肿瘤免疫：
那么Fn具体是通过什么来引发这样的抗肿瘤免疫反应的呢？由于Fn是微生物，所以他们分析了脾CD8+T细胞与Fn的培养基上清进行孵育。结果发现Fn的培养基上清，降低了CD8+T细胞上PD-1的表达。而通过代谢组学，他们分析了Fn的具体哪些代谢产物有所提高（下面的热图大家应该都能看懂了吧，不清楚的话，可以回去看看《夏老师带你读文献》复习下），结果发现丁酸是富集最多的候选代谢物。为了确定丁酸的功能，他们使用丁酸钠处理了CD8+T细胞，结果发现Fn的确是通过其代谢物丁酸，降低PD-1表达并重新激活CD8+T细胞：
那为了说明这个丁酸的来源是Fn，他们对Fn本身进行了突变操作，突变了丁酸合成过程中关键的FN0271（烯酰辅酶A水合酶），而Fn在突变后无法生成丁酸，而丁酸生物合成缺乏的Fn突变体，则无法在体外激活CD8+T细胞和抗PD-1治疗反应（这里其实就是针对于Fn的丁酸合成进行的缺失验证，通过这个验证，很好地将验证命题的外延缩小在了Fn合成丁酸上，也就避免了肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题的外延和内涵以及肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
为了确定Fn合成的丁酸在人体免疫系统中提高抗PD-1的疗效，他们就建立了来自同一患者的自体PBMC（外周血单核细胞）衍生的CD8+T细胞，并且将其与原代CRC类器官共培养。Fn的培养基上清以及丁酸，可以促进类器官的抗PD1疗效，而突变的Fn培养基上清，则无法产生这样的功能。也就是说，Fn通过丁酸生物合成提高与自体CD8+T细胞共培养的MSS的CRC患者来源类器官的抗PD1疗效：
接着他们进行了体内的验证，Fn-丁酸盐可以通过减轻CD8+TIL耗竭并重新激活其细胞毒功能。而使用抗CD8α抗体，抑制了CD8+T细胞后（这里通过抑制CD8+T细胞，来明确Fn-丁酸轴具体的作用机制，不能缺少了CD8+T细胞的参与，这其实也是柯霍氏法则的验证过程，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》），Fn及丁酸盐对于抗PD1治疗的疗效也降低了，也就是说Fn-丁酸盐，是以CD8+T细胞依赖性方式促进MSS的CRC中的抗PD1免疫治疗效果：
那么Fn及丁酸盐到底是通过什么途径影响CD8+T细胞的呢？通过RNA测序，他们对与FN0271敲除的Fn和野生型Fn的培养基上清共培养的CD8+T细胞进行了分析。结果发现野生型Fn共培养的CD8+T细胞中TBX21表达明显上调，TBX21是一种在活化的T细胞中表达的关键转录因子，对于T细胞的活化有着关键作用。而丁酸会促进TBX21的组蛋白H3K27乙酰化，从而激活TBX21的转录激活：
最后就形成了这样的示意图，Fn通过释放代谢产物丁酸，促进了CD8+T细胞中TBX21的启动子组蛋白H3K27的乙酰化，从而激活TBX21转录。TBX21激活了T细胞，抑制了T细胞中PD1的表达，从而提高了抗PD1治疗的疗效：
这篇文章总的来说，做得非常细致，在每个步骤的验证都是比较严谨的。但最后关于丁酸盐与TBX21的机制上，总还是觉得有点意犹未尽，期待他们接下去的研究了。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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