阳性率飙升至99%的CAR-T阳性细胞富集小妙招

CAR-T细胞产品的一个主要障碍是最终产品中CAR-T阳性细胞数量的差异性，这使得数据比较变得困难。因此非常有必要开发一种标准化的CAR-T细胞纯化方法，以便于比较临床前和临床研究，并提高研究效率。

大部分CAR设计离不开scFv, 而scFv的构成需要使用linker连接重链可变区VH和轻链可变区VL，研究人员常用的linker是G4S, 因此理论上利用anti-G4S的抗体可以富集大部分CAR-T阳性细胞。

近日《免疫学方法杂志》上发表了对这一理论进行了系统性验证的文章。

具体操作步骤如下：

1. 细胞重悬与标记：

将300万T细胞重悬在50微升的MACS缓冲液中，该缓冲液是由PBS补充1%（体积/体积）热灭活的胎牛血清组成。向细胞中加入1.5微升的PE标记的抗G4S连接子抗体（克隆号E7O2V，来自Cell Signaling Technology公司）。

2. 孵育：

 将细胞与抗体在4°C下孵育5分钟。

3. 洗涤：

通过两次2毫升MACS缓冲液的洗涤步骤去除未结合的抗体。

4.二次标记：

将洗涤后的细胞重悬在80微升MACS缓冲液中，然后加入20微升的抗PE微珠（由Miltenyi公司提供），再次在4°C下孵育15分钟。

5. 再次洗涤：

使用2毫升MACS缓冲液再次洗涤细胞，去除未结合的微珠。

6. 加载MACS柱：

将细胞重悬在500微升MACS缓冲液中，然后加载到已经安装了预分离滤器并放置在磁力架中的MS MACS柱上。

7. 柱洗涤：

用500微升MACS缓冲液洗涤滤器一次，然后丢弃滤器。

8. 细胞分离：

从磁力架上取下MS柱，用500微升MACS缓冲液冲洗柱子三次。

9. 收集细胞：

将MS柱从磁力架上移开，通过添加1毫升MACS缓冲液并使用柱塞将细胞推过柱子来两次洗脱细胞。

10. 细胞重悬：

最后，将细胞重悬在培养基中以供进一步使用。

这个步骤是利用PE标记的抗G4S连接子抗体和抗PE微珠通过MACS技术来实现CAR-T细胞的磁珠分离。这种分离方法旨在从混合细胞群体中高效地富集表达特定CAR结构的T细胞。

从文章中的数据来看富集纯度可以到达99%以上。

除了CD39 略微上升一些，其余检测markers在富集前后未检测到差异。

综合来看，该方法可以比较方便的对CAR-T阳性细胞进行富集，这无论是对研发阶段的功能比较还是对后期临床应用都有很好的参考价值。

参考文献

https://doi.org/10.1016/j.jim.2024.113667