编辑 | 澹泊研究僧
来源 | NIRO（ID：NIRO-keyanmiao）
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图片来源: NIRO科研喵小红书
这期为了解释这个问题，找了篇文章
《
Comprehensive Optimization of Western Blotting
》
进行说明。这篇文章讲的是对凝胶制备、电泳、转膜、封闭和裁膜等步骤的优化，通过优化后大大提高实验效率，降低实验成本。
该文章主要从这几个方面进行对WB实验体系进行优化:
通过对预混制胶试剂的简化配制。TEMED催化AP产生自由基，形成三维网络，若不加的这部分可长期呈现液体状态。
但结果表明不加AP的其他试剂可以预混合制胶试剂形成混合的母液备用，并放置4℃避光保存可达1个月或更长时间。
为了加快凝胶速度可以通过TEMED和AP进行调整。通过这样优化配胶试剂将在很大程度上节约时间。
图片来源: 《Comprehensive Optimization of Western Blotting 》
通过传统的电泳运行缓冲液配方(Tris 19.2 mM，甘氨酸19.2 mM, SDS 3.5 mM, pH 8.3)与改进的电泳缓冲液的配方进行对比(Tris 38.1 mM，甘氨酸266.7 mM, HEPES 21.0 mM, SDS 3.5 mM, pH 8.3)，
发现改进后的电泳缓冲液配方在室温200v 35min内就可以完成电泳
；更令人惊讶的是，在300v 还可以正常工作，但需要进行冰水浴来散热。
图片来源
:
《
Comprehensive Optimizatio
n
of Western Blotting
》
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《
Comprehensive Optimizatio
n
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》
通过使用半干转转膜电泳缓冲液(Tris 36.9 mM，甘氨酸39.1 mM, SDS 1.3 mM， 20%乙醇)，
用20%乙醇进行替代甲醇后，可以有效减少甲醇蒸汽。同时也发现在被测蛋白中，GAPDH、CD81、CyC的信噪比在两组间无统计学差异。
然而，在乙醇组中，PINK的信噪比最强。
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《
Comprehensive Optimizatio
n
of Western Blotting
》
这里就不具体讲了，刚兴趣阅读原文参考文献。因为这期主要讲解乙醇可以替代甲醇进行转膜的。
通过实验结果可知，
0.22 μm PVDF膜转小蛋白的效果明显强于0.45 μm PVDF膜和0.45 μm NC膜
，而0.45 μm NC膜比0.45 μm PVDF好用。
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《
Comprehensive Optimizatio
n
of Western Blotting
》
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《
Comprehensive Optimizatio
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可防止一抗非特异性结合，提高信噪比，对于一些高质量的抗体，可能不进行阻断。
作者比较了聚乙烯吡咯烷酮(PVP-40)与5%脱脂乳的封闭效率。
PVP-40封闭10分钟的蛋白信号强度显著高于脱脂牛奶封闭1小时，但是PVP-40在室温下只能储存一周，而添加0.05–1%无毒的ProClin可以大大延长保质期。
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《
Comprehensive Optimizatio
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》
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