酵母单杂交技术衍生于酵母双杂交GAL4系统，是一种在酵母细胞内分析鉴定转录因子与目的基因启动子相互作用的有效方法，被广泛用于研究真核细胞内基因的表达调控，如鉴别DNA结合位点、发现潜在的结合蛋白、分析DNA结合结构域信息等。
将已知的特定顺式作用元件或目的基因的启动子序列构建至最小启动子（Minimal promoter, Pmin）的上游，报告基因连接在特定顺式作用元件或目的启动子下游，构成包含目标DNA元件（Bait sequence）的诱饵载体。将转录因子构建至可以表达转录激活结构域（AD）的载体上，表达形成融合猎物蛋白（Prey）。如果特定顺式作用元件或目的启动子和转录因子结合就会激活Pmin，从而促使报告基因表达。因此，可以通过检测报告基因表达与否来判断特定顺式作用元件或目的启动子与转录因子是否发生互作。
图1 酵母单杂原理。图片来源：伯远生物。
目前常用的酵母单杂系统包括Y1H Gold-pAbAi和Y187-pHIS2系统，二者的实验流程类似，只是所用的载体不同，载体携带的抗性基因不同，因此筛选抑制诱饵质粒自激活时所用的药品也不同。Y1H Gold-pAbAi系统使用金担子素A（Aureobasidin A）筛选阳性克隆，Y187-pHIS2系统则使用3-氨基-1,2,4-三唑（3-AT）筛选阳性克隆。以Y1H Gold-pAbAi系统为例，图2展示了酵母单杂点对点的实验流程。
表1 伯远生物酵母单杂系统。
图2 基于Y1H Gold-pAbAi系统的酵母单杂点对点实验流程图。图片来源：伯远生物
。
2021年7月，CSIR-印度综合医学研究所植物生物技术部以及科学和创新研究所Nasheeman Ashraf课题组在
Plant Molecular Biology
杂志上发表了一篇题为“Crocus transcription factors CstMYB1 and CstMYB1R2 modulate apocarotenoid metabolism by regulating carotenogenic genes”的研究论文，作者为了解析CstMYB1和CstMYB1R2的作用机制，通过酵母单杂交的方法检测出了它们分别与类胡萝卜素途径基因
PSY
和
CCD2
启动子的相互作用。
首先，作者克隆了
PSY
和
CCD2
的启动子，并进一步扩增出了100bp
PSY
和170bp
CCD2
启动子的野生型片段，分别记为pPSYwt、pCCD2wt，它们分别含有一个和两个MYB结合区域。另外，作者也构建了它们的突变形式——一个PSY突变型（pPSY-mut），两个CCD2突变型（pCCD2mut1：只有一个MYB结合位点发生突变、pCCD2mut2：两个MYB结合位点都发生了突变）。分别用野生型和突变的启动子片段制备诱饵菌株，并通过检测每个诱饵菌株的最低AbA浓度，推断它们与CstMYB1和Cst-MYB1R2的相互作用。结果显示，对于PSY启动子，只有pPSYwt与CstMYB1R2互作，而pPSY-mut与CstMYB1R2不互作，这一结果表明了CstMYB1R2-PSY相互作用的特异性（图3a）。同时，作者还观察到CstMYB1、CstMYB1R2分别与pCCD2wt共转的酵母细胞可以在添加了AbA的选择性培养基上生长，这证实了CstMYB1和CstMYB1R2与CCD2启动子的相互作用。然而，pCCD2mut1分别与CstMYB1、CstMYB1R2共转的菌株可以在含有200ng/mL AbA的选择培养基上生长，pCCD2mut2分别与CstMYB1、CstMYB1R2共转的菌株无法在选择培养基上生长（图3b）。综上，CstMYB1仅与
CCD2
启动子直接结合，而CstMYB1R2同时与
PSY
和
CCD2
启动子结合。
图3 Y1H实验显示CstMYB1和CstMYB1R2与启动子（a）
PSY
及其突变形式、（b）
CCD2
及其突变形式的结合
(Bhat et al., 2021)
。注：转化子在SD/-Ura-Leu培养基上生长，并添加了200ng的AbA。
1、诱饵载体存在自激活怎么办？
A：pAbAi-bait存在自激活，需要设置梯度浓度AbA的SD/-Ura平板培养以筛选出能够抑制自激活的AbA浓度；pHis2-bait存在自激活，需要设置梯度浓度3-AT的SD/-His/-Trp平板培养以筛选出能够抑制自激活的3-AT浓度。
2、如果出现自激活无法抑制的情况怎么办？
A：首先核对菌落涂布方法。涂板或者点板的菌浓度是造成自激活抑制结果不一致的主要原因。因此需要确保不同组合的菌液浓度一致。然后核对自激活体系是否正确。建议选用pAbAi-P53做对照，已知pAbAi-P53存在自激活，而且100-200ng/mL的AbA可以抑制其自激活现象。如不能抑制，则说明筛选培养基配制错误。当AbA浓度达到1000ng/mL，或3-AT浓度达到120mM，诱饵自激活还是无法抑制，那说明插入的Bait自激活过强，无法进行筛库以及验证实验。需要重新构建Bait。
3、猎物蛋白（转录因子）对报告基因AbAr具有转录抑制作用？
A：如果转录因子本身对报告基因AbAr具有转录抑制作用，可能会导致产生假阴性结果，可以更换Y187-pHIS2体系，检测报告基因HIS3的表达产物，再次进行验证。
酵母单杂交技术的优点
1、酵母单杂交体系能在一个实验过程中识别与DNA特异结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列，而无需分离纯化蛋白，实验简单易行。
2、由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而具有很高的灵敏性。
3、目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交体系的使用提供了有利的条件。
酵母单杂交技术的缺点
1、有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用，或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录，往往会产生假阳性结果。
2、如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，或融合蛋白发生错误折叠，或者不能定位于酵母细胞核内，以及融合的GAL4 AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶元件的能力，从而产生假阴性结果。因此，为了得到较准确的结果一般都会和其它的验证方法一起结合使用。
客户需要我司构建酵母单杂载体可根据以下要求寄送材料，也可寄送构建好的诱饵和猎物质粒。
