几千年来，家蚕（Bombyx mori）的丝腺能够合成大量高分子量的丝蛋白来生成丝纤维，为丝绸工业做出了巨大贡献。因此，丝腺被认为是一种生物反应器，可以在丝纤维中产生外源蛋白，用于生物制药或制造功能性丝生物材料。这种分泌物的主要成分是丝素蛋白，被认为是一种有前途的组织修复和工程生物材料。为了进一步扩大这种独特蛋白的用途，需要继续对丝素蛋白进行功能化。
基于此，来自西南大学科学中心种质创制前沿研究中心夏庆友/王峰等人
建立了一种高效的Fib-H
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生物合成体系，利用转基因家蚕在丝纤维中合成大量重组RFP，约占丝质量的7.86%，实现了荧光丝素蛋白（SF）生物材料的制备。
通过基因工程葡萄糖氧化酶(GOx)功能化的丝纤维，可制造具有抗菌活性的GOx-SF水凝胶，通过葡萄糖与葡萄糖酸和H
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的酶催化反应促进小鼠感染糖尿病伤口的愈合，从而验证了Fib-H
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系统的通用性（方案1）。
相关研究成果以“
An Efficient Biosynthetic System for Developing Functional Silk Fibroin-Based Biomaterials”
为题于2024年12月12日发表在
《Advanced Materials》
上。
方案1 一种新开发的丝腺生物合成系统示意图，该系统实现了外来蛋白质在丝纤维中的高效表达以及丝素蛋白基生物材料在组织工程中的功能化
1.转基因家蚕重组蛋白生物合成体系的构建
本研究首先通过基因工程构建了三类新型Fib-H
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系统，随后它们显微注射到家蚕胚胎中，获得了从卵到G1代幼虫蛾期持续表达的可遗传转基因家蚕（图1b），分别命名为FRF-D9L、HFRF-D9L和HFRS-D9L。观察了不同转基因家蚕品系中RFP的表达情况，发现HFRS-D9L和HFRF-D9L的幼虫体和游走期的丝腺在自然光激发下也能发出可见的红色荧光（图1c，d）。荧光观察进一步表明，与HFRF-D9L和FRF-D9L染色相比，HFRS-D9L在丝腺中表现出最强的RFP表达（图1d），这表明hr3CQ增强子和Ser1PA元件的协同作用显著增强了基础Fib-H启动子的转录效率，实现了转基因蚕PSG中重组RFP的生物合成。
作者观察了各转基因家蚕品系茧中RFP的表达情况。结果表明，与FRF-D9L和WT-D9L相比，HFRS-D9L和HFRF-D9L的茧在自然光激发下呈现可见的红色荧光（图1e）。对各转基因家蚕品系丝纤维横截面的荧光观察也表明，与HFRF-D9L和FRF-D9L相比，HFRS-D9L在丝纤维的丝素蛋白层中表现出最强的RFP表达（图1f），这表明HFRSEXP成功地将RFP从PSG细胞分泌到丝纤维中形成茧。SDS-Page和Western印迹分析表明，RFP在FRF-D9L、HFRF-D9L、HFRS-D9L菌株的茧中均成功实现了天然分子量的重组表达（图1g，h）。HFRS-D9L和HFRF-D9L菌株茧中RFP含量分别比FRF-D9L菌株提高了7.2倍和4.1倍，表明优化的HFRSEXP实现了天然分子量的重组蛋白在PSG中的高效表达并分泌到蚕丝纤维中。
图1 转基因家蚕重组蛋白大量生物合成的Fib-H
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体系的构建
2.利用Fib-H
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系统在转基因蚕中大量生物合成重组RFP，用于制造荧光丝生物材料
为提高HFRS-D9L的RFP茧产量以满足材料需求，作者按照前期的策略将HFRS-D9L菌株（图2a）与富含丝胶的棉茧家蚕工业品系（图2b）进行多重杂交，至少杂交五代，选出棉茧体积较大、茧色较白、茧壳重较重的个体（图2c），形成稳定的品系HFRS-棉茧染色（HFRS-CC），该品系可大量产出粉红色的RFP茧丝（图2d-f）。作者还设计了RFP荧光丝素蛋白材料的制备工艺（图2g）。首先将从HFRS-CC收获的RFP茧磨成丝粉，通过碱性蛋白酶酶解提取 RFP 溶液。从该过程中获得的RFP溶液纯度很高，因为碱性蛋白酶水解了大多数内源性丝杂质。因此，使用一步亲和层析可以从约100 g HFRSCC茧中纯化约12.5 mg RFP，纯度超过98%（图2h）。在RFP纯化后，剩余的丝纤维用于制备再生丝素蛋白溶液。
将纯化的RFP与再生丝素蛋白溶液按所需比例混合，得到RFP-丝素蛋白溶液，进一步用于制备RFP荧光丝素蛋白薄膜（图2i）、可注射RFP荧光丝素蛋白水凝胶（图2j）和多孔RFP荧光丝素蛋白海绵（图2k，l），这些海绵呈现荧光信号，揭示制备过程在材料加工过程中保持了RFP的生物活性。
图2 利用Fib-H
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系统在转基因蚕中生物合成重组RFP以制造荧光丝生物材料
3.利用Fib-H
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系统对转基因蚕丝中重组GOx进行生物合成
葡萄糖氧化酶（GOx）是一种天然酶，可结合葡萄糖并催化其转化为葡萄糖酸和过氧化氢，因此被认为是抗菌和调节糖尿病伤口高糖微环境的候选药物。为了实现GOx在家蚕丝中的高效表达，根据家蚕的密码子使用偏好对黑曲霉（A. niger）GOx成熟肽的编码序列进行优化，进行商业合成，并插入HFRSEXP，形成转基因表达载体pBac-HFGOxS（图3a）。然后将转基因表达载体pBac-HFGOxS显微注射到家蚕胚胎中，获得从卵到G1代幼虫期3×P3DsRed持续表达的可遗传转基因家蚕（图3b），命名为GOx-D9L。然后用SDS-PAGE分析来自sgGOx-D9L的茧蛋白，与WT组相比，在70和100 kDa蛋白质前导序列之间显示出明显的蛋白质条带（图3c）。
溶液状态的GOx在烤箱中65°C热处理6小时后迅速失去酶活性，而蚕丝纤维在65°C烘箱中处理6小时和7天后，GOx酶活性分别保持≈98.44%和≈73.67%（图3d）。
此外，在25°C的PBS中浸泡6小时和7天时，蚕丝中GOx的酶活性几乎不受影响，即使在65°C的PBS中浸泡6小时和7天后，仍保持相当高的酶活性≈65.83%和≈28.43%（图3e）。
这些结果表明天然蚕丝纤维很好地保护了GOx的酶活性，与溶液条件下的GOx相比，其热稳定性更好。
为了优化GOx丝的产量，按照上述策略将GOx-D9L蚕与富含丝胶的棉茧蚕工业菌株进行多杂交。选取棉茧体积较大、茧色较白（图3f）、茧壳重量较大（图3g）且GOx表达量与GOxD9L相当（图3h）的个体维持为GOx-CC菌株，实现白色GOx茧的大量生产，并从1kg GOx-CC茧中高效纯化约1.38g GOx重组蛋白，纯度超过95%（图3i）。
图3 利用Fib-H
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系统在转基因蚕丝纤维中大量生物合成重组GOx
4.利用具有高效级联催化活性的GOx丝纤维生成无菌介质、H
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和羟基自由基(OH)来制造抗菌丝素蛋白水凝胶
细菌共培养后的GOx茧丝的SEM显示，金黄色葡萄球菌 (S. aureus；图3j) 和大肠杆菌 (E. coli；图3k)均未在GOx丝纤维上附着或生长，而WT丝纤维上的细菌附着和生长良好。抑菌圈测定表明，WT茧盘在S. aureus 平板（图4a、b）和E. coli平板（图4c、d）上均未产生抑菌圈，而GOx茧盘和3% H
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在处理后8小时产生了抑菌圈。金黄色葡萄球菌（图4e）和大肠杆菌（图4f）的细菌培养液在与GOx蚕丝共培养10小时后呈透明状，无生长趋势，而与WT蚕丝共培养10小时后，细菌培养液浑浊，有明显生长。这些结果表明GOx-CC蚕合成的GOx蚕丝保留了较强的催化和抗菌活性。
为了探索GOx丝作为伤口愈合的抗菌材料，用PBS从干纺GOx丝纤维中提取了生物活性的GOx蛋白，在还原（图4g）和非还原SDSPAGE（图4h）中显示出不同的单体形式或二聚体形式，表明提取处理没有破坏GOx的结构。提取物中GOx的含量估计为≈0.14 mg mL
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，对金黄色葡萄球菌（图4i，j）和大肠杆菌（图4k，l）也表现出很强的抗菌作用，显著抑制细菌的生长。
图4 评估葡萄糖存在下GOx-silk的抗菌效果
为了制备抗菌丝素生物材料，作者制备了4种丝素蛋白水凝胶，包括WT-SFH、WT/Fe3O4SFH、GOx-SFH和GOx/Fe3O4-SFH（图5a）。其中将Fe
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纳米颗粒引入到GOx/Fe
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-SFH中，进一步催化GOx产生的H
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转化为具有抗菌活性的羟基（·OH），作为与GOx结合产生自由基用于糖尿病伤口治疗的候选物质。
通过对水凝胶的光学、孔结构、孔径范围、孔隙率、溶胀率、降解行为等性质进行表征，表明水凝胶适合作为软组织工程的3D基质。
图5 利用具有高效级联催化活性的GOx丝纤维
生成无菌介质H
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和羟基自由基（·OH）来制造抗菌丝素蛋白水凝胶
5.GOx丝素蛋白水凝胶具有强效抗菌特性，可促进慢性感染性伤口愈合
与GOx-SFH和GOx/Fe
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-SFH共培养10小时的金黄色葡萄球菌（图6a）和大肠杆菌（图6b）的培养液透明且没有生长趋势，而与WT-SFH和WT/ Fe
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-SFH共培养10小时后，菌液浑浊且有明显的生长趋势。将与不同水凝胶共培养10小时的菌液进一步涂覆在培养板上，
结果表明，与WT-SFH和WT/Fe
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-SFH相比，GOx-SFH和GOx/Fe
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-SFH处理显著抑制了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的生长（图6c）。进一步通过各组菌落形成数（CFUs）、SEM分析以及抑菌圈试验均表明GOx-SFH和GOx/ Fe
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-SFH具有催化和抗菌活性。
此外，水凝胶还具有良好的细胞相容性（图4j-k）和血液相容性（图4l-m）。
图6 水凝胶的抗细菌、抑菌作用和生物相容性的评价
最后，作者建立了糖尿病伤口感染小鼠模型（图7a），感染金黄色葡萄球菌30分钟后，将WT-SFH、GOx-SFH和GOx/Fe
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-SFH施用到糖尿病小鼠的伤口上，具有良好的粘附性和透明度，可用于伤口管理和观察，用盐水润湿后可轻松从伤口上取下。到第7天，实验组糖尿病小鼠伤口在第12天大部分愈合（图7b-d）。糖尿病小鼠第7天伤口渗出液的平板分析显示，与空白组和WT-SFH处理的伤口相比，实验组处理的伤口上几乎检测不到金黄色葡萄球菌（图7e）。这些结果表明GOx-SFH和GOx/Fe
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-SFH有效抑制了金黄色葡萄球菌的生长，从而显著促进了慢性伤口愈合。HE和Masson染色进一步表明实验组创面的修复效果更好（图7f-g）。
图7 GOx丝素蛋白水凝胶具有强效抗菌特性可促进慢性感染性伤口愈合
此外，免疫荧光分析显示，经GOXSFH和GOx/ Fe
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-SFH处理后，CD31（血管生成标志物）（图8a，b）和CD206（M2标志物）（图8c，d）信号明显增强，表明血管生成加速，巨噬细胞由M1型向M2型有效复极化。这些结果表明GOX-SFH和GOx/Fe
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-SFH通过加速血管生成来促进血管化，通过调节巨噬细胞的极化发挥抗炎作用，为实现上皮和真皮组织更好的发育。
图8 糖尿病小鼠伤口组织的免疫荧光分析
综上，本文成功构建了Fib-H
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系统，实现了在PSG和MSG细胞中合成具有天然分子量的外源蛋白，以及在转基因家蚕丝纤维中分泌和分布这些蛋白。具有生物活性的重组蛋白获得了高表达，并被高效纯化为原料制备了功能性丝素蛋白材料，包括RFP功能化丝素蛋白材料（可展示在材料加工过程中外源蛋白的生物活性的保持）和GOx功能化丝素蛋白材料（可促进感染性慢性伤口的愈合）。这些结果表明，所建立的Fib-HEXP系统为通过遗传方法对丝素蛋白生物材料进行功能化提供了途径，从而拓宽了这种生物材料在一系列潜在应用中的用途。
参考资料：
https://doi.org/10.1002/adma.202414878
来源：
EngineeringForLife
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