长春应化所陈学思院士、宋万通等ACS Nano：优化T细胞纳米接合器的表面抗体价数以实现对实体瘤的有效T细胞重定向治疗！

T细胞重定向疗法（T cell redirecting therapy）是肿瘤免疫治疗的一个重要分支。与需要抗原触发肿瘤免疫循环的免疫治疗策略不同，T细胞重定向疗法旨在直接“操控”T细胞、利用其自发或人工赋予的抗原识别能力来直接杀死肿瘤细胞，而这其中的关键问题在于如何高效地实现对T细胞的精准驾驭。双特异性T细胞接合器（Bispecific T-cell Engager，BiTE）疗法是T细胞重定向疗法的典型策略，通过引入能同时靶向结合T细胞和肿瘤细胞的可溶性双特异性抗体分子来引导T细胞与肿瘤细胞的直接物理接触，从而诱导T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤。相比于细胞水平的T细胞工程化策略（如嵌合抗原受体T细胞/CAR-T疗法），这种基于通用型功能分子的T细胞重定向疗法能规避个性化调控的时间和经济成本，代表了一种更灵活的策略。

近年来，将纳米材料技术应用于免疫细胞接合器策略的研究引起了广泛关注。研究人员将接合器分子的多个完整分子或功能片段修饰到纳米载体表面以构建出纳米接合器结构，从而能通过纳米载体表面功能配体的多价性和多特异性实现单个受体信号的增强响应以及不同受体信号的时空共激活。然而需要特别注意的是，结构和功能的集成化与多样化也增加了这种多价纳米结构体内作用机制调控的复杂性，特别是被用于静脉系统给药治疗实体瘤时。因为纳米接合器的多价结合模式虽然能增强其对靶细胞的结合亲和性，但也容易导致其在外周循环中被免疫细胞提前结合甚至内化，且多价的激活抗体还可能会导致免疫细胞的过早激活、引起脱靶毒性，如细胞因子释放综合征（CRS）。因此，阐明表面抗体价数对纳米接合器的作用机制和治疗效果的具体影响至关重要，以充分利用其结构优势并增强其安全性。

基于此，中国科学院长春应用化学研究所陈学思院士、宋万通研究员团队构建了基于聚乳酸纳米材料的T细胞纳米接合器（T cell nano-engager, TNE: αCD3×αPDL1），并提出通过斐波那契球面点阵模型分析纳米载体表面抗体片段的分布参数，从而能够深入研究表面抗体价数对TNE的介导机制和抗肿瘤效力的具体影响。结果显示，当αCD3抗体片段的价数控制在一定范围内（使得载体表面αCD3抗体片段最小间距大于常规二价抗体结合臂距离~13 nm）时，TNE能稳定预结合在T细胞表面而不会引起T细胞的提前激活；进入体内后，激活抗体αCD3片段和靶向抗体αPDL1片段的价数比例会影响TNE在体内的分布规律，其中当αCD3与αPDL1的价数比为25:50时TNE的生物分布表现和抗肿瘤效果最好；而具有优化表面抗体价数的TNE结构能有效促进外周T细胞富集到实体瘤部位，并改善肿瘤免疫微环境、实现对实体瘤的有效抑制。该研究以题为“Tuning surface valences of nano-engagers to enhance their structural advantages for efficiently redirecting T cells against solid tumors”的论文发表在最新一期《ACS Nano》上。

【T细胞纳米接合器（TNE）的制备与表征】

纳米接合器的纳米载体由MalPEG-b-PLA通过纳米沉淀法制备而成，通过马来酰亚胺-巯基的点击化学反应将还原型的抗体片段修饰到球体表面上（图1a）。为了合理地定量抗体的相对价数，作者提出使用斐波那契球面点阵模型拟合抗体片段在球形纳米载体表面的分布状态（图1b），从而能根据蛋白修饰量计算抗体片段在纳米载体表面的修饰价数、间距等分布参数。如图1c-e所示，本工作选择了anti-PDL1和anti-CD3抗体作为T细胞纳米接合器的两端特异性靶向功能模块，并通过冷冻电镜表征其纳米结构形态，验证抗体片段在纳米载体表面的分布状态。

图1. T细胞纳米接合器的制备与冷冻电镜形态表征

【表面抗体价数对TNE靶向结合活性的影响】

根据前面提到的球面点阵模型，作者通过控制点击化学反应的反应率和投料比分别制备了具有不同αCD3抗体或αPDL1抗体价数而保持另一端抗体价数不变（50价）的TNE（CTNE和PTNE）（图2a）。不同价数的PTNE和CTNE分别对E0771细胞和T细胞的结合亲和力通过逐级稀释法测定的离解常数进行评价。结果如图2b-c所示，随着结合抗体价数的提高，TNE对靶细胞的结合亲和力也随之提高。如图2d-f所示，TNE对T细胞的非特异性激活效果与CD3抗体的价数和颗粒的浓度有关。在合适的浓度（NP>5nM）下，当TNE的CD3抗体价数提高到75价以上时（CTNE-75和CTNE-100），它们就会导致T细胞的包括IL-2和IFN γ等细胞因子的释放，且CTNE-100的刺激效果显著高于CTNE-75。

图2. 不同抗体价数下TNE对靶细胞的结合亲和性和刺激活性

当存在靶细胞时，TNE还会更容易激活T细胞。正如图3所示，与单独跟T细胞孵育的结果相比，在靶细胞存在下，高CD3抗体价数的TNE（CTNE-75和CTNE-100）能刺激T细胞释放更高水平的细胞因子，而部分低价数的CTNE（CTNE-25 和 CTNE-50）也能被激发出激活T细胞的潜力，在CTNE-50中尤其明显。

图3. 存在靶细胞的情况下TNE对T细胞的刺激活性

【抗体价数比例对TNE体内分布规律和抗肿瘤活性的影响】

将TNE的αCD3抗体价数设置为25或50（PDL1价数固定为50）制备可控激活预修饰T细胞纳米接合器（Controlled Activation and Prebinding T cell Nano-Engager, CAP-TNE），并通过荧光标记示踪法研究它们在体内的命运。如图4a-b所示，这两种CAP-TNEs到达体内之后都能迅速且高效地结合体内的外周T细胞。它们经静脉注射进入体内的1 h后就能修饰接近80%的循环T细胞。CAP-TNEs的另一端αPDL1抗体价数可能会影响其余大部分CAP-TNEs在体内的分布。本工作制备了五种具有不同价数比例的CAP-TNEs，其αCD3:αPDL1价数依次是25:25, 25:50, 25:75, 50:50和50:75（分别命名为CAP-TNE-1, 2, 3, 4, 5），经过荧光标记后通过静脉注射输入荷瘤小鼠体内（图4c）。活体荧光成像和离体器官荧光成像结果显示（图4d-e），不同价数的CAP-TNEs主要在肝部和肿瘤部位富集，其中CAP-TNE-2具有最佳的肿瘤富集效果。

图4. 不同价数比例的TNEs的体内生物分布

具有不同抗体价数比例的CAP-TNEs表现出不同的抑瘤活性。在E0771肿瘤模型中（图5a）,CAP-TNE-3组和CAP-TNE-4组的肿瘤抑制率相似，分别为37%和33%。CAP-TNE-1和CAP-TNE-5 两组可以中等延迟肿瘤生长，肿瘤抑制率分别为60%和64%。CAP-TNE-2 的肿瘤抑制效果最好，肿瘤抑制率达到了90%。而CAP-TNE-2在MC38肿瘤模型和B16F10肿瘤模型中也能实现77%和80%的肿瘤抑制率（图5b-c）。对E0771肿瘤进行流式细胞术免疫分型及SNE降维分析（图5d），结果显示经过CAP-TNE-2治疗后的肿瘤内CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的比例都出现提升，且T细胞的激活水平（CD69⁺）和增殖活性（Ki67⁺）都有显著的增强。

图5. 不同价数比例的CAP-TNEs的抑瘤活性及其瘤内免疫分析

总结：作者构建了基于聚乳酸纳米材料的T细胞纳米接合器（αCD3×αPDL1），并借助斐波那契球面点阵模型分析调控TNE表面抗体价数，深入研究了表面抗体价数（单抗体价数和双抗体价数比例）对TNE的靶向结合活性、介导细胞激活/杀伤活性、体内生物分布规律、体内抑瘤活性等作用过程的影响。结果显示，较低的anti-CD3抗体价数（25）和适中的anti-PDL1抗体价数（50）能在保证TNE对外周T细胞的稳定预结合的同时，促进TNE向实体瘤部位的高度富集。而能在实体瘤部位实现最高富集的CAP-TNE-2具有最好的抑瘤效果。这些结论有利于拓展对TNE的构效关系的理解。