嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）基因工程改造的T细胞疗法能够显著延长癌症晚期患者的寿命。几十年来，癌症治疗都是依赖于生物物理方法，先是手术切除，随后是放疗和化疗，这两种方法主要针对快速生长的肿瘤细胞而不影响静息的正常组织。后来的一大突破是针对白血病患者的同种异体骨髓移植，该方法时而有效。在发现肿瘤浸润淋巴细胞能够扩增并用于治疗甚至治愈转移性黑色素瘤患者后，治疗实体瘤的过继细胞疗法又得到了发展。鉴定出肿瘤特异性T细胞受体（T-cell receptors，TCR）并将其导入患者的外周血淋巴细胞，结果发现其也能用于治疗肿瘤。然而，这会受到患者HLA的限制。随后CAR出现了，其实现了抗体的精确识别与T细胞的效应功能的相互结合。用于治疗多种形式晚期B细胞恶性肿瘤患者的CD19靶向的CAR取得了巨大的成功，实现了高达95%的应答率。虽然应用CAR治疗实体瘤才刚刚起步，但某些因素已经很明确了：对临床医生来说无害的肿瘤靶标是最重要的；另外实体瘤对CAR疗法的响应有别于血液病。在此我们回顾了临床基因工程T细胞免疫疗法的现状，其取得的成就，面临的挑战以及未来的发展。

T细胞介导的免疫治疗是对不具特异性、有时还具有高毒性的手术、放疗和化疗等治疗方法的一次革命。过继细胞疗法治疗癌症的第一个成功案例发生于1956年的纽约，E Donnall Thomas医生对一位白血病患者实施了致死剂量的辐射治疗，随后又为其进行了来源于同卵双胞胎的骨髓移植（bone-marrow transplant，BMT），结果移植物抗肿瘤（graft-versus-tumor，GVT）的活性使得白血病完全消失，Thomas也凭借这一成就获得了1990年的诺贝尔奖。随后的十来年，由于移植物抗宿主症（graft-versus-host disease，GVHD）的存在，BMT仅限于使用同卵双胞胎供体，这种情况一直持续到使用非双胞胎的同胞兄弟/姐妹供体来减少潜在的HLA错配。1979年，在华盛顿州西雅图，来自无关供体的HLA部分匹配的骨髓移植拯救了一名白血病患者。非相关供体BMT疗法至今仍然是许多类型白血病的唯一治疗选择，但价格昂贵，且易引发GVHD，其在某些情况下可能非常严重甚至致命。

很快到了21世纪，来自美国国立癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）的Steven Rosenberg领导的课题组首次报道使用提取于肿瘤的T细胞（即肿瘤浸润淋巴细胞，tumor-infiltrating lymphocytes，TIL）进行体外扩增并重新输注回患者体内成功治疗了转移性黑色素瘤。但该方法也存在一定问题：并非所有患者的肿瘤均可切除；即使那些可切除的肿瘤也不是都能生长淋巴细胞；即使能生长淋巴细胞，这些淋巴细胞也并非都具有抗肿瘤活性；即使具有抗肿瘤药活性，T细胞体外扩增至能用于治疗的水平也需要八周以上的时间，许多患者未必等得及。除此之外，许多类型的肿瘤不产生TIL，而且这些细胞的培养和测试需要高昂的设备和人力成本。因此，尽管这种治疗策略的客观反应（objective response，OR）率高达50%，但应用并不广泛。

能够识别不同患者体内肿瘤的“普适性”T细胞成为解决这一困境的良方。在利用TIL治疗黑色素瘤的实践中发现，不同患者的T细胞都识别黑色素瘤的高表达抗原MART-1和gp100。NCI的Nicholas Restifo课题组构建了T细胞介导的黑色素瘤免疫疗法的临床前研究小鼠模型，支持了这些观察结果，并为进一步发展临床疗法，解释T细胞抗肿瘤机理等提供了新的方法。

靶向于黑色素瘤共有抗原的T细胞可用于治疗拥有相同HLA患者的相似肿瘤。基于这一理论，研究人员筛选了DMF4这一优势T细胞克隆，然后利用逆转录病毒转导使患者的T细胞表达DMF4的TCR，并将其输注回患者体内（图1）。Steven Rosenberg课题组的Richard Morgan于2006年发表了其基因工程MART-1 TCR临床试验结果，尽管12%的反应率低于预期，但从概念上证明了基因工程改造的外周血T细胞用于治疗晚期转移性癌症是可行的。

进一步优化该方法需要解决的问题包括：（1）MART-1作为靶标是否足够合适；（2）TCR的亲合力是否重要。

对MART-1 表位（27-35）以及gp100的三个表位（209-217，280-288和154-162）的研究表明，有响应患者的TIL中的T细胞克隆对MART-1反应的比例最高。对这些克隆进行分析发现，相应原始克隆的亲合力（avidity）越高，其转导得到的T细胞的亲合力也越高。

上述工作的后果是证明临床中使用的DMF4相比于其他克隆属于中低亲合力的克隆。因此，又进行了一项针对DMF5克隆的临床试验。结果在治疗转移性黑色素瘤时发现，大部分患者在细胞输注5天后出现顽固的皮疹，通常随后还会出现色素脱失和白癜风症状。有几名患者还抱怨出现视力或听力障碍，检测表明，这是由于MART-1 TCR T细胞侵袭了其皮肤、耳朵甚至眼睛，损伤了其中的着色细胞。在DMF5的临床试验中，30%的患者表现为客观响应，高于DMF4临床试验的结果。

同时，一项针对gp100的鼠源高亲和力TCR的临床试验也得到了类似的结果，表现出很高的脱色自毒性以及/或眼和耳毒性（80%），另外抗肿瘤有效性（OR）为19%。这些结果表明手提的亲和力很重要，且工程改造的T细胞可以成为强力的治疗工具，但是将来对靶标的选择需要非常小心。

第一项针对非黑色素瘤恶性肿瘤的TCR临床试验紧随上述工作展开，TCR的靶标是睾丸癌抗原NY-ESO-1、癌胚抗原CEA或者黑色素瘤抗原编码基因（MAGEs）。针对NY-ESO-1的HLA-A2限制的高亲合力1G4 TCR是第一个针对非黑色素瘤肿瘤的基因工程TCR。临床试验中使用γ-逆转录病毒将NY-ESO-1 TCR导入T细胞，客观临床响应在滑液细胞瘤患者中为4/6，在黑色素瘤患者中为5/11。跟进到2015年，相应数据分别为11/18（61%）和11/20（55%）。3年和5年整体生存率在肉瘤中分别为38%和14%，在黑色素瘤中均为33%。宾夕法尼亚大学大学的Carl June课题组利用慢病毒载体进一步发展了这种TCR疗法以治疗多发性骨髓瘤患者，在I期/II期临床试验中临床响应率为16/20（80%），且TCR阳性细胞能够在患者血液中高水平维持很长时间。

截止到2016年，共有九项临床试验利用了NY-ESO-1 TCR，用于治疗膀胱癌、乳腺癌、食道癌、肺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、成神经细胞瘤、卵巢癌、滑液细胞瘤、非小细胞肺癌（NSCLC）以及其他转移性癌症的患者，详见www.ClinicalTrials.gov和表3。

在NCI，HLA-A2转基因鼠已被用于分离高亲和力的人CEA TCR，以用于治疗转移性结直肠癌患者。三例患者的血清CEA水平降低了74%-99%，而且其中一名患者客观上实现了肿瘤消退，证明了抗肿瘤活性的存在。然而，三名患者均出现了严重的急性自身免疫性结肠炎，这大概是由于正常CEA表达受影响导致的。由于毒性作用，该试验被迫终止。

靶向MAGE的TCR临床试验目前已有三项独立报道：NCI的Steven Rosenberg课题组靶向MAGE-A3/ HLA-A2以治疗转移性黑色素瘤、滑液细胞瘤或食管癌患者；UPENN的Carl June课题组靶向MAGE-A3/HLA-A1以治疗两名骨髓瘤和黑色素瘤患者；来自日本的Hiroshi Shiku课题组靶向MAGE-A4/HLA-A24:02以治疗复发性食管癌患者。

NCI的临床试验治疗了九名患者，其中五名出现客观临床响应。然而另有三名患者在治疗的两天中出现了严重的精神状态问题，其中两名陷入昏迷并最终死亡。尸检显示存在T细胞输入相关的广泛坏死性脑白质病。经过分析发现，试验中使用的TCR对MAGE-A9和MAGE-A12 有交叉反应，而MAGE-A12在人脑中是正常表达的，这被认为是毒性产生的根本原因。

UPENN的临床试验仅治疗了两名患者，一位罹患多发性骨髓瘤，另一位则是黑色素瘤患者。MAGE-A3/HLA-A1 TCR取自一位免疫接种的患者，并经过了亲和力改造。前两位患者均发生了心源性休克，且在T细胞输注后两周内死亡。尸检显示死亡原因为心脏组织发生了广泛的T细胞浸润和弥漫性肌细胞坏死。分子水平的原因是一种无关的肌肉特异性蛋白Titin能够在HLA-A1裂隙中形类似靶标的肽段。由此提出的一个尚不确定的问题是增加TCR的亲和力是否可能导致脱靶效应从而针对其他类似的肽段。

靶向MAGE-A4/ HLA-A24:02的临床试验没有得到那么明显的结果：输注的T细胞能够维持长达五个月的时间，但没有观察到客观响应，毒副作用也很小。

最近，以人乳头瘤病毒（HPV）抗原为代表的非自身抗原靶向的TCR成为新的研究点。目前NCI的Christian Hinrichs正在进行一项关于HPV E6 TCR免疫疗法的临床试验，该疗法用于治疗HPV相关的阴道癌，宫颈癌，肛门癌，阴茎癌和口咽癌。目前进行的基因工程TCR治疗癌症的临床试验参见表3。

尽管TCR基因工程T细胞疗法的有效性已经得到了证明，但其仍面临一些限制。首要的也是最重要的是其治疗患者的局限性。患者的肿瘤不仅要表达靶标蛋白，还必须与TCR的单倍型限制相匹配，此外HLA分子和胞内加工的肽段必须同时呈递与肿瘤细胞表面。这就使得治疗必须限制在小部分患者身上。

CARs的概念最早由Zelig Eshhar及其同事于1989年提出。相关成果发表于《美国国家科学院院刊》，他们将一株单抗的重链和轻链可变区连接于TCR的恒定区并转染至一种T淋巴细胞系获得了免疫球蛋白-T细胞受体嵌合分子。随后他们又进行了改进：将轻重链可变区通过linker连接得到单链片段（scFv），从而无需进行多重基因转移即可实现抗体样受体的特异性。当scFv结合于相关抗原，CAR即通过CD3ζ链发出信号，激活带有受体的T淋巴细胞。第一代CAR的特点是仅包含单个胞内信号转导结构域。在评估第一代CAR的早期的临床癌症试验中，涉及的CAR靶标包括卵巢癌患者的叶酸受体、肾癌患者的碳酸酐酶IX（CAIX）以及神经母细胞瘤儿科患者的CD171 / L1-CAM。这些早期试验没有证明细胞的长期维持和抗肿瘤效应，反而在CAIX临床试验中出现了意想不到的胆道毒性，相关报道阐述了这种中靶但未作用于肿瘤的潜在风险。

2008年，贝勒医学院的Malcolm Brenner及其同事首次报道了CAR的阳性临床结果。使用的第一代CAR靶向神经母细胞瘤儿科患者的二唾液酸神经节苷脂GD2，尽管治疗后24小时血液中检测到的转移细胞即低于0.1%，但十一名患者中三名的症状完全缓解。这些结果表明CAR T疗法具有引发有效抗肿瘤响应的潜力，但迫切需要解决的问题是延长患者体内CAR T细胞的维持时间。

早期的第一代CAR由scFv和CD3ζ链组成，后期的临床改进包括加入共刺激分子如加入4-1BB以上调抗凋亡因子Bcl-xL从而延长T细胞存活时间，加入CD28以提高T细胞响应的效力等。这些改进后的CAR则称为“第二代”（一个共刺激分子）或“第三代”（多个共刺激分子）。目前CAR还会和共刺激受体的配体如4-1BBL联合使用。

利用第三代CAR治疗转移性黑色素瘤患者的第一个临床试验靶标是ERBB2/HER2。近年来，HER2已成为一个有效的免疫治疗靶标，主要是在赫赛汀辅助治疗乳腺癌切除患者时使用。由于HER2安全性好，NCI已选择赫赛汀抗体的scFv构建治疗HER2阳性转移性黑色素瘤的CAR。第一例接受治疗的患者在接受了彻底的淋巴清除后输注了高剂量（1 × 10¹¹）的细胞。在输入细胞的几分钟内，患者即感觉十分痛苦，随后陷入昏迷，X射线检查显示存在高水平的肺部浸润；尽管进行了高剂量的类固醇医疗干预，患者还是在5天后死亡。尸检显示，输注的CAR T细胞扩散到了身体的多个区域，且在肺部高度聚集，导致相关组织损伤。患者死后的组织检查表明，患者的死因是HER2抗原在肺上皮中的表达。已发表的CAR治疗实体瘤的临床试验结果见表2。

HER2 CAR临床试验中患者的死亡对正在进行的抗原靶标选择造成了巨大影响。为谨慎起见，需要寻找完全肿瘤特异性的抗原，但这类抗原少之又少，或者寻找在肿瘤组织和非关键组织中共有的抗原。在血液肿瘤学领域，靶向多种B细胞相关的恶性肿瘤为此提供了一个契机。CD19和CD20是B细胞表面表达的细胞分化抗原。尽管B细胞是分泌抗体的浆细胞的前体细胞，但先天B细胞缺失的个体也有记载，通过预防性地输注γ-球蛋白其基本上能够正常生活。最早用于治疗血癌的CAR之一靶向CD20，但在输注后CAR T细胞的维持和影响微乎其微。

CD19 CAR治疗白血病的临床结果则鼓舞人心。根据2010年公布的结果，Steven Rosenberg课题组的James Kochenderfer利用γ-逆转录病毒载体的第二代（CD28共刺激）CD19 CAR治疗一名晚期滤泡性淋巴瘤（FL）患者，结果患者的癌细胞和B淋巴细胞都被消除，且在整个39周的随访期间稳定维持。跟进到2012年，共8名患者参与试验治疗，6/8患者病情得到缓解，4/8患者正常B细胞长期消失。此外，5/8患者血液中的CAR T细胞在外周血单核细胞（PBMC）中的比例超过1%，在输注后10天左右达到峰值，其中两名患者甚至达到10%以上。不过，所有患者血液中CAR T细胞的水平在治疗后一个月恢复到<0.01%。

2011年UPENN的Carl June课题组发表的病例报告中，一位慢性淋巴性白血病（CLL）患者接受了慢病毒载体的第二代（4-1BB共刺激）CD19 CAR的治疗。该患者癌症完全缓解，正常B细胞消失，另外由于体内大量CAR T细胞释放细胞因子而出现了显著的免疫相关性发热。抗肿瘤效应在8个月的随访期间稳定维持。该研究最令人感兴趣的地方在于患者接受的CAR T细胞数非常低，仅为1.42 × 10⁷。其他研究一般都会高出2-3个数量级，达到10⁹-10¹¹。

2011年，Renier Brentjens和Michel Sadelain也报道了在纽约史隆凯特琳纪念癌症中心（MSKCC）进行的第二代（CD28共刺激）CD19 CAR治疗九例CLL或急性淋巴性白血病（ALL）患者的临床试验，给药剂量约为10⁷ cells/kg，患者预先接受或不接受Cy介导的淋巴消除预处理。在第一组中，3名患者未接受Cy处理，所有患者的病情均发生快速进展。采用淋巴细胞预消除的方案，大部分患者均在细胞注射24小时内出现发热。除一名CLL患者持续发热并在48小时内死亡外，其余患者均为短暂发热。患者死亡的最终原因尚不明确，据作者推测这可能是由治疗前存在的败血症导致。一名CLL患者的肿瘤尺寸初期有短暂增加，但随后部分减小并持续到治疗后6个月。另一名接受治疗的缓解期ALL患者出现正常循环B细胞减少并持续到8周后，在其接受了同种异型BMT后排除出组。值得注意的是，CAR T细胞在输注两周后即从所有患者的循环中消失，而且作者还发现细胞消失的速度同肿瘤负荷成正比。

由于这些成功的CD19 CAR的报道，针对FL、CLL和ALL患者的后续试验大量展开，且随访时间更长，也有其他的B细胞恶性肿瘤患者。其中最值得注意的是对一位多发性骨髓瘤（MM）患者的成功治愈。

尽管MM可能来源于B系细胞，但其通常被认为是完全分化的，CD19阴性的浆细胞疾病。2015年，UPENN Carl June课题组的Alfred Garfall和Edward Stadtmauer发表了CD19靶向、4-1BB共刺激的CAR治疗一例MM患者的报道。患者为43岁女性，曾接受高剂量化疗和自体干细胞移植，病情部分缓解但持续了不到6个月。此后她又进行了九次化疗但无一成功。尽管其几乎完全（99.95%）是CD19阴性的骨髓瘤，但经过CD19 CAR T细胞治疗，其在一年后仍保持完全缓解的状态。据推测。这可能是由于该治疗能靶向CD19阳性的肿瘤干细胞从而导致肿瘤的消除，或者是由于该治疗在消除整个B细胞库的同时也消除了促进肿瘤、抑制免疫的细胞群。该试验共治疗了十名MM患者，其中（不包括前述病例）五名在结果发表时已维持35-222天无进展。

CD19靶向的CAR在淋巴性白血病治疗中的成功鼓舞了其他血液靶标CAR的研究。尽管靶向CD19已经取得可观的高响应率，但也存在部分复发患者不再对CD19响应，另外更明显的是并非所有血癌都发生于B细胞。Clinicaltrials.gov网站目前列出了分别在中国和UPENN/NIH进行的使用CD138和B细胞成熟抗原（BCMA）治疗骨髓瘤的开放性免疫治疗试验；以及分别在中国和UPENN进行的靶向CD33和CD123治疗急性髓性白血病（AML）的开放性免疫治疗试验。治疗血癌的CAR在多篇综述已有大量讨论，此处不再详述。

关于任何类型的癌症治疗的一个重要事实正如格言所述，“那些不能杀死我们的，使我们更强大”。当靶向“自我恶化”的靶标时，可能会附带损其余好的部分，在传统的放疗和化疗中这是显而易见的。在过继性T细胞免疫疗法中基本前提似乎也是相同的：攻击越猛烈，效果越好。因此，尽管靶标特异，但有时副作用是全身性的。激活的T细胞会产生高水平的炎性细胞因子，对身体有强烈影响，会导致严重损伤甚至死亡，其广义术语被称为“细胞因子释放综合征”（CRS）。临床医生的传统解决方法是高剂量的全身性皮质类固醇治疗，但问题在于类固醇一般是通过关闭免疫系统，尤其是T细胞发挥其作用的。所以CD19 CAR临床试验中的难题在于：治疗CRS的风险/益处何时高于抗肿瘤功能的潜在疗效？

在许多CD19 CAR治疗的白血病患者中，CRS已成为临床抗肿瘤反应的相关因素。所以临床医生和病人在T细胞输注后发现发烧或皮疹时会非常激动。CRS的诊断和治疗是一个不断发展的科学，但目前发现减少IL-6似乎是有效的。

最近，UPENN的课题组已经确定了24种CD19 CAR-T治疗后的预测性生物标志物，并进一步发现可以用三种特异性标志物在治疗早期确定那个患者可能发生严重的CRS。有趣的是，尽管预测成人和儿童患者的CRS均是利用三种特异性标志物，但其在标志物的特异性却有所不同。对成人患者，soluble gp130（sgp130）、IFNγ、IL1RA可用于预测CRS，但对于儿童患者，则需要使用IFNγ、IL13和MIP1α作为标志物。达成一致的治疗方案是利用Tocilizumab中断IL-6/IL-6R信号，这通常可在24-36小时内缓解症状。但遗憾的是，即使使用Tocilizumab治疗，仍有2/14的患者死于CRS，因此仍有必要去开发更好的早期鉴别方法和更有效的治疗方法。

由于最近出现三例死亡病例，美国FDA暂停了一项一期临床试验，这使得CD19 CAR疗法面临的形式更为复杂。死亡原因是脑水肿，发生于CAR T治疗前接受fludarabine治疗的特定患者中。由于该试验是由Juno Therapeutics这样的大公司进行的，因此相关新闻迅速广泛传播，从而导致了对CAR-T疗法安全性和未来的疑问。不过，仅三天后，研究组即获批恢复无强化化疗方案的临床试验。其他试验中也发生了脑水肿之类的神经系统毒性效应，该效应与脑脊液中出现的CD19 CAR T细胞相关，且无法通过Tocililzumab封闭。不幸的是，移除化疗方案并不足够，不久之后该试验中又出现了两例死亡病例。对死因的进一步调查以及脑毒性的预防和治疗非常必要，且将持续进行，而且这些工作可能需要不受血脑屏障（BBB）限制的介入方式，如类固醇的全身性给药，或者mAb治疗剂如Tocilizumab的鞘内输送。

血癌治疗中引人注目的结果促进了CAR领域的复苏。大型制药公司首次开始表现出兴趣，并竞相与学术中心合作，投入惊人的数以亿计美元的资金（平均学术研究预算）用于CAR-T免疫治疗的研究与开发。作为交换，企业将拥有所得研究产品的知识产权或许可权或其组合。第一个大新闻是诺华制药与UPENN合作，随后是新成立的Kite Pharma与NCI签订研究协议。另外纽约MSKCC的Michel Sadelain、Renier Brentjens和Isabelle Rivière，哈奇森癌症中心/西雅图儿童医院的Stanley Riddell、Philip Greenberg和Michael Jensen合作成立了自己的公司Juno Pharmaceuticals进行CAR研究，经费来源是私人投资和上市股票。其他大型制药公司如Eli Lily、GlaxoSmithKline、Janssen和Merck也已在投资开发利用CAR技术的平台。此外，为了利用这项技术，该领域还有一系列的新公司成立，如Bluebird Technologies、Bellicum、Cellectis和Intrexon-Ziopharm。

从CD19靶向的CAR转向实体瘤治疗有更多的困难。不幸的是，该领域的新晋者普遍认为“CAR对实体瘤无效！”这个说法的起源是未知的，可能是根据实体瘤的CAR治疗缺少积极报道的现状而推断的。目前，已完成的使用第二代和第三代CAR治疗实体瘤恶性肿瘤的临床试验报道很少。例外情况包括两个病例报告和19例患者临床试验的结果。第一个病例是NCI外科的Steven Rosenberg课题组于2010年报道的，这是第一例使用第三代CAR治疗实体瘤的报道，治疗的是一位难治性转移性黑色素瘤患者。不幸的是，在输注大量（10¹¹) HER2 CAR T细胞后，这名患者经历了致命的严重不良反应（SAE），这可能是由肿瘤脱靶，但靶向正常组织的毒性导致的。另一个是Baylor最近发表的使用第二代CAR治疗实体瘤的报道，同样也是靶向HER2抗原，治疗的是难治性转移性肉瘤患者（19例，其中16例为骨肉瘤）。可以理解的是，该试验首先用了一个非常低的剂量（最低为10⁴细胞，最大为10⁸细胞）。该试验没有表现出明显的毒副作用，而且确实显现出了有效的迹象，正电子发射断层扫描（PET）一名患者出现了部分肿瘤反应。第一个针对不同靶标（间皮素，meso）的第二代CAR的报道是UPENN发表的，描述的是两名患者接受meso靶向的RNA CAR治疗，其中一位患者患有恶性胸膜间皮瘤（MPM），另一位患有转移性胰腺癌。试验未观察到毒副作用，且MPM患者出现了短暂的部分抗肿瘤反应。目前发表的其他实体瘤CAR临床试验利用的是CD19成功前时期所用的第一代构建方法。尽管起初的临床试验显示GD-2和IL13Rα靶向的第一代CAR对于疾病的微乎其微，但同时也出现了CAR T细胞植入和维持不足的问题。事实上，在开发出具有共刺激因子的新一代CAR后，这些试验也成为了继续前进的动力。早期试验面临的另一个阻碍是T细胞中载体输送和基因表达的效率不高。使用的这些技术遇到的问题包括基因转移效率低、需要长时间的体外扩增、转基因T细胞需要反复刺激等，其中很多问题本身就对体内治疗非常不利。

随着研究的复苏，有关临床前CAR的报道大量涌现；然而，最热门是一个新出现的主题：疗效和毒性的关系。由于癌症来源于正常细胞，选择能够导致肿瘤消退而不损害正常组织的攻击靶标非常困难。第一次的HER2 CAR悲剧就是一个惨痛的教训，揭示了这些T细胞的强大杀伤力，以及选择安全靶标的重要性。问题在于已知的绝对肿瘤特异性的表面蛋白甚至是与非关键组织共享的表面蛋白都非常少。正如MART-1、gp100和CEA的研究中所发现的那样，在靶向T细胞治疗中，所谓的“肿瘤相关的”或“胚胎”抗原在成人组织仍然可能被证明是必需的。

在多形性胶质母细胞瘤（）中，靶向表皮生长因子受体变体三（EGFRvIII）的CAR是一个理想的选择，其能够提供15个月的预后生存期，且三分之一的肿瘤均表达该肿瘤特异性表面蛋白。包括我们在内的数个课题组已经发表了在临床前小鼠模型中利用人或鼠CAR靶向EGFRvIII进行治疗的研究结果。由于EGFRvIII是一个肿瘤特异性的突变蛋白，EGFRvIII CAR不大可能导致正常组织毒性；但是，鉴于EGFRvIII与正常EGFR的结构相似性，交叉反应的可能性也无法完全排除。

作为临床转化的先决条件，为了排除与野生型EGFR蛋白的交叉反应性，我们在蛋白质相互作用水平上评估了抗EGFRvIII scFv与正常EGFR结合的能力，然后在体外评价了EGFRvIII CAR 与已知的高水平表达EGFR的原代皮肤细胞（角质形成细胞）的作用。最后，我们还使用EGFR CAR作为阳性对照，在人类皮肤移植的鼠模型中对CAR进行了体内评价，结果显示，EGFRvIII CAR对正常EGFR无毒性或交叉反应性。因此，UPENN已经在两个地点（UPENN和UCSF）利用4-1BB共刺激的EGFRvIII CAR治疗GBM患者。此外，NCI的Steven Rosenberg课题组也在开展一项CD28和4-1BB共刺激的EGFRvIII CAR治疗高评分胶质瘤患者的开放临床试验。最近，ClinicalTrials.gov网站显示杜克大学也在开展一项EGFRvIII CAR GBM临床试验。

IL13Rα2作为嵌合T细胞靶标的临床前研究已经持续了十来年，该分子在GBM中高表达，而在正常组织中低表达甚至不表达。Michael Jensen以前在City of Hope的课题组做了大量工作来开发非scFv的CAR，该CAR利用一种重组IL13“zetakine”分子，该分子相比于IL13Rα1，增加了对IL13Rα2的亲合力。2015年，他们发表了采用高达12剂CD8⁺T细胞治疗3例复发性GBM患者的临床试验的结果，该细胞表达第一代zetakine CAR，同时携带HyTK药物选择/自杀基因融合蛋白。不幸的是，由于该试验采用DNA质粒电转进行基因导入，还需再进行药物筛选，然后再对细胞进行大量的体外扩增，总共需要3-4个月的时间进行准备，因此尽管注册的志愿者有10名，但仅有3名活到了CAR治疗的时刻。这些CAR T细胞无法在患者体内维持，据作者报道，原因是缺少共刺激信号和HyTK蛋白的免疫原性。所有患者在细胞输注前均进行了肿瘤切除，因此无法确定抗肿瘤功效，而且3名患者在治疗后不到一年的时间你内即全部死亡。

与在正常组织中相比，许多肿瘤相关的共同抗原（TAA）在癌症中具有超生理学表达水平的表达。这也是继续追求将一些TAA作为CAR靶标的根本原因。这些类型的靶标可以在多种不同类型的癌症中高表达，相比于正常组织，它们或是表达水平有异，或是表达位置不同。除了HER2，还有大量的此类分子在进行I期临床试验的评价，如mesothelin、cMet、MUC1、GD2、EphA2、EGFR、CD171和CD133等。此外，还有一些共同抗原并非直接呈现于肿瘤上，而是位于肿瘤特异性的微环境中，如成纤维细胞激活蛋白（FAP）和血管内皮细胞生长因子受体（VEGFR）-2。

“治疗窗口”的概念已讨论许久，此处CAR可能仅仅靶向那些异常高水平表达靶抗原的组织（如肿瘤）。这在TCR领域已经得到了观测证实，在该领域可以利用T细胞激活所需表面肽的最小量来判断T细胞的亲合力，然而在CAR领域还鲜为人知。这可能是由TCR和CAR各自独特的生物学特性造成的。TCR：MHC相互作用的亲和力通常在微摩尔范围，而抗体或scFv与靶抗原表位相互作用的亲和力则通常在纳摩尔范围。在NCI关于MART-1 TCR基因工程改造T细胞疗法的临床试验中我们观察到了亲和力的影响。用高亲和力的DMF5 TCR（KD为43μM）主要会导致对皮肤、眼睛和内耳中黑色素细胞的毒性，同时抗肿瘤效应的客观反映率为30%；而采用低亲和力的DMF4 TCR（KD为170 μM）时则无黑色素细胞毒性，OR为13%。相比之下，CAR临床研究中使用的scFv的亲和力范围不同，通常比TCR高3个或以上的数量级。比如，我们在UPENN进行的GBM临床试验中人源化EGFRvIII 2173 CAR的亲和力为101nM，而以前NCI的HER2 scFv亲和力为0.58nM。

最近刚刚有报道证实了scFv的亲和力水平对CAR功能和抗原识别的影响。2015年，Cancer Res同期发表了两篇论文，一篇来自UPENN的Yangbing Zhao课题组，另一篇来自MD Anderson Cancer Center的Laurence Cooper课题组，两组作者利用突变改变了EGFR和/或HER2靶向的scFv的亲和力，并评价了亲和力改变对CAR杀伤肿瘤和正常细胞能力的影响。有趣的是，两组研究人员都发现了亲和力的“甜蜜点”，位于该点时，无论体外评价还是老鼠模型的体内评价均发现肿瘤能够被CAR T细胞识别，而正常细胞则不受影响。Baylor的临床试验结果也证明了这一点，采用靶向其他HER2表位的另一个scFv构建的HER2 CAR T细胞（高达10⁸细胞）对19位患者均五毒副作用。

鉴于第一次HER2 CAR临床试验中的不幸死亡事故，研究人员考虑在基于共同抗原的疗法时变得非常谨慎。限制CAR针对这些抗原潜在毒性的一种方法是限制治疗的暴露持续时间。目前，UPENN的June课题组正在研究这种方法，采用的形式是使用meso靶向的CAR RNA电转T细胞治疗meso阳性的实体瘤（胰腺癌、卵巢癌和间皮瘤）患者。体外获取CAR RNA，电转至患者的T细胞然后再回输给患者。该方法转移效率很高，超过90%的细胞就能表达CAR基因，但是在电转过程中会损失大约50%的细胞。此外，CAR只能在细胞表面表达大约七天的时间，因此T细胞必须在此期间遭遇肿瘤细胞才能发挥作用。因此，这些细胞属于“一次性”打击，细胞输注需要多次重复才能起效。尽管在该临床试验中未观察到靶点相关的毒性，在一位患者身上仍然观察到了抗肿瘤效应。结合起初的安全性数据，在UPENN，meso靶向的CAR-T细胞临床试验已经改用慢病毒转导的T细胞；另外，NCI、MSKCC和中国也有正在进行的meso靶向的CAR T细胞试验。

UPENN的一位患者以每次间隔数周的方式接受了多次meso靶向的RNA CAR治疗，其发生的情况非常清楚地揭示了在重复输注CAR T细胞需要注意的另一个事项。UPENN的meso靶向的CAR为鼠源，因此在会患者中引发抗鼠的免疫应答。重复治疗导致患者对鼠源蛋白发生了迅速而严重的过敏反应，需要进行类固醇干预才能终止这一反应。

降低毒性的另一个方法是肿瘤内（IT）CAR T细胞的局部注射。该方法的原理是T细胞必须停留在肿瘤位点发挥作用，而不是像静脉注射那样随血流扩散到全身。尽管该方法对大范围扩散或转移的癌症不适用，但对局部癌症如GBM等可能有效。Michael Jensen课题组在IL13Rα2 CAR T细胞疗法的研究中已经利用了这一思路，Baylor大学的Gottschalk/Ahmed课题组用HER2 CAR治疗GBM采用的递送方法也是这一思路。

Baylor的课题组降低毒性所尝试的另一个方法是大大降低CAR T细胞的给药剂量。在NCI最早的HER2 CAR的临床试验中，第一个也是唯一一个得到治疗的患者的给药剂量非常高（10¹¹）。Baylor最近进行的临床试验不仅将给药途径改为肿瘤内给药，还使用了剂量递增方案，起始量为10⁷细胞，最高剂量为10⁸细胞，连续两天分两次注射，每次5×10⁷细胞。另外，Baylor还有两项HER2 CAR临床试验，一用于是治疗GBM，二是所谓的“吊桶试验”，治疗所有HER2阳性的恶性肿瘤。每个试验都是静脉注射CAR T细胞，但是其起始剂量更低，随后再进行剂量升级。吊桶试验于2009年开放，但目前还没有招募志愿者，其需要的起始剂量是10⁴细胞/m²体面积（对一个典型的成年人即相当于总共约10⁴细胞）。

Baylor的第一个HER2 GBM临床试验开放于2010年（目前也没有招募志愿者），起始剂量略高，但相比于其他实验仍然很低，为10⁶细胞/m²，随后再进行剂量升级，而且该试验使用高度选择的CMV特异性的记忆T细胞进行CAR转导和扩增。对于过继细胞疗法最好的细胞的决定因素见仁见智，Baylor课题组的结果表明用病毒特异性的记忆细胞或许能够提供最好的疗效。尽管细胞筛选能够找出非常明确的细胞亚群作为起始材料，但缺点是体外刺激和扩增的次数以及达到治疗要求的细胞数量所耗费的时长。不过，当靶向HER2这样的共有抗原时，使用这类细胞能够可能会增加安全性，因为在体外对这些细胞进行反复刺激可能会限制其在体内消耗、衰老或被消除之前被激活的整体潜能。

有一种限制毒性的机制可能会偶然发生——针对鼠scFv蛋白的内源性免疫排斥反应。在进行任何CAR临床试验之前，都会对诱导针对小鼠来源的mAb scFv的鼠源部分的免疫应答反应的潜力进行推测。在NCI临床试验中，黑色素瘤患者接受了表达gp100特异性TCR的自体T细胞的治疗，这些TCR源自HLA-A2转基因小鼠，对这些患者血清进行的回顾研究揭示了HAMA的发展。有意思的是，这种从体内去除TCR和CAR工程T细胞的机制并会影响CD19 CAR临床试验中的细胞维持或者效果成功，因为除了肿瘤，所有正常B细胞也都被清除了，因此无法激发基于抗体的反应。但是在治疗实体瘤或者CD19阴性白血病的患者时，这种免疫原性可能会成为治疗的障碍，也可能会带来限制长期脱靶毒性的好处。最近，为了试图降低HAMA免疫原性，已经对鼠源scFv CAR做了大量外源序列的人源化工作。

在早期的自杀基因如HSV / TK表现出高免疫原性之后，对无免疫原性且能有效调节患者体内CAR T细胞活性的系统的寻找已经进行了很长时间。关闭T细胞功能的传统方法是类固醇全身给药，其可在数小时内减轻少炎性症状和T细胞活化成都。但单独的类固醇不足以扭转损伤，新的方法要求能立即关闭T细胞，或者更坑能的是直接破坏CAR T细胞。

目前MSKCC正在进行一项吊桶型临床试验，利用CD28共刺激meso靶向的CAR治疗meso阳性实体瘤，所用细胞引入了安全开关。这些细胞包含一个可诱导的Caspase 9蛋白（iCasp9），其在一种药物递送至患者体内时能够能够迅速被激活。这种快速激活的可行性在于该系统不依赖新基因的转录或新蛋白的翻译，恰恰相反，改造后的caspase 9在持续表达。该蛋白仅在形成二聚体后才会激活，而二聚化则依赖于一种特殊药物。激活的二聚体蛋白迅速引发细胞凋亡。其最初是作为过继性T细胞疗法中的切断开关，但目前已适用于基因工程改造的TCR和CAR领域，而且或许能在任何肿瘤脱靶毒性中都发挥作用。

目前ClinicalTrials.gov在列的CAR T细胞治疗实体瘤恶性肿瘤的临床试验共39项。大部分靶向肿瘤相关自体抗原如HER2、GD2、CMET、EGFR、MUC1、EpaA2、GPC3、CD133和CD171。一小部分靶向非肿瘤靶标，但这些靶标对肿瘤在体内生长存活是必需的，如VEGFR或FAP。最近又鉴定出一类新的肿瘤靶标，其穿越于典型突变或者过表达肿瘤抗原的裂隙，是翻译后修饰产生的。我们最近报道了一个肿瘤特异性CAR靶标，其通过MUC1表面蛋白的糖基化呈现，在数种癌症间是一致的，但不见于正常组织。这些试验结果应该将在不久后公布，可能有助于解决目前该平台治疗实体瘤所面临的困难。

与工程化T细胞免疫疗法的发展同步，最近癌症免疫疗法领域在整体上已经取得了巨大的飞跃，特别是免疫检查点阻断抗体的发展。一系列涉及T细胞开关的免疫检查点分子同T细胞在体内实现抗肿瘤功能的能力直接相关。目前在CAR的设计中已经考虑了T细胞激活蛋白这一条胳膊，加入了诸如CD28、4-1BB、OX-40、ICOS、CD27等共刺激分子以及其他增强功能的分子。但是，还有一条更隐蔽的胳膊被许多癌症尤其是实体瘤恶性肿瘤利用了。这些隐蔽的蛋白被称为免疫检查点调节分子，功能是通过促进PD1、CTLA4、TIM3、LAG3和VISTA等T细胞表面分子的表达来关闭T细胞。利用抗体封闭PD1和CTLA4介导的T细胞抑制在临床上取得了巨大成功，已报道的能够消退的肿瘤包括黑色素瘤、肺癌、梭形细胞癌和肾细胞癌。

目前认为检查点抑制抗体的作用机制是激活内源性抗肿瘤T细胞以破坏肿瘤靶标，而且相同的原理在基因工程TCR和CAR T细胞治疗肿瘤患者时也适用。在对使用TCR工程细胞治疗后患者的血液进行的早期相关性研究中，有反应和无反应患者之间的区别就在于前者血液中的工程细胞在离体后遇到肿瘤能立即发挥作用。无论反应与否，所有患者的循环系统均有高水平的工程T细胞，在治疗后一个月平均也有20%的循环T细胞。然而，只有那些来自于有临床反应的患者的T细胞才能在体外对肿瘤暴露起反应，产生IFNγ和IL2；而来自无反应患者的TCR阳性的外周血淋巴细胞则失去了对肿瘤反应的能力。在一项关于患者天然的肿瘤浸润淋巴细胞的同步研究中也观察到了类似的现象，MART-1 TCR阳性T细胞无法产生1型细胞因子以响应刺激；在该研究中发现，受抑制的T细胞选择性表达PD1，与能产生1型细胞因子且PD1阴性的MART-1 TCR阳性细胞正好相反。

最近发现许多内源性T细胞针对的肿瘤抗原实际是肿瘤细胞中发展出的非同义乘客突变，而不一定非司机突变不可，该发现可能会指导我们使用TCR来鉴定MHC上呈现的细胞内突变的蛋白质。选择CAR而不是TCR既有益处（无MHC限制），又有不足（仅适用与共有的表面蛋白），而且两者都面临相似的问题（自身抗原毒性）。

基因工程T细胞应用于癌症患者的临床治疗所面临的一部分问题是，该领域过于新颖，研究人员和临床医师仍需学习该系统的生物学知识和相应的“规则”。仅仅选择靶标对于预测毒性或有效性是不够的，其他的影响因素还包括将基因递送到T细胞中以维持转基因表达的方法（DNA / RNA /质粒，γ逆转录病毒，慢病毒，非病毒转座子重组），T细胞体外刺激的方法（mAbs、微珠、细胞、抗原），T细胞体外扩增的方法（细胞因子混合物、培养时间、细胞是否筛选），以及T细胞亚群（幼稚T细胞、效应T细胞、记忆T细胞）。所有这些微小的差别都会影响T细胞在患者体内的移植、生存和功能。构建产物的长度、铰链区域的选择、靶抗原表位的位置等因素都很关键且因人因事而异。此外，共刺激分子的选择也是一个有争议的问题。两个最常用的分子CD28和4-1BB似乎在体内作用迥异，而在体外却功能相似。CD28似乎初始时刻作用更强，从而有助于其实肿瘤的破坏，但CAR T细胞的消除也更快。4-1BB正相反，作用起始过程更缓和，但能孵育CAR T细胞更长的生存期和移植期，使其能够在患者体内维持数月甚至数年。除了使用典型的T细胞基因外，最近一项报道用NK细胞的信号蛋白2DS和DAP12替换了CAR T细胞分子（CD3ζ和共刺激结构域），结果带来了临床前小鼠实体瘤模型中CAR体内抗肿瘤功能的显著增加。

即使没有已经指出的这些差异，靶向完全相同的抗原也可能具有不同的结果，这取决于靶向的抗原表位或mAb scFv的亲和力。最近有两篇靶向肿瘤基质相关FAP的临床前论文发表，两者均使用同基因的临床前小鼠模型，并显示出类似的体外功能。一组（Rosenberg，NCI）发现FAP CAR T细胞在小鼠模型中具有急性毒性，而抗肿瘤活性却很微弱，因此反对将FAP作为临床靶标。但另一组（Puré，UPENN）的发现完全相反：他们未观察到体内毒性，而是观察到了抗肿瘤活性，因此鼓励在临床上使用FAP CAR。经过仔细调查发现，最主要的区别在于后者使用4-1BB，而前者使用的是CD28，另外他们使用的是不同的FAP靶向的mAb scFv。这表明，两个结果可能都是正确而得；但每个单独的构建方法、靶标选择和治疗方式都需要经验性的测试来进行评估。

100种不同类型的实体瘤似乎更像是100种不同的疾病，每种疾病的治疗都有不同的障碍。可能只有借助基础科学研究才能阐明在每种情况下所遇到的抑制障碍。例如，胰腺癌会形成基质组织构成的物理障碍以阻止T细胞，而多种GBM则是分泌转化生长因子（TGF）β和表达T细胞抑制性配体。令人欣慰的是，随着资本和利益涌入临床免疫疗法的开发，现在治疗癌症已经有了更多的工具可供单独使用，或者更多的是组合使用。老的治疗方法包括化疗和放疗也展现出了与新发现的免疫疗法如TCR、CAR和检查点抑制抗体协同作用的能力。快速积累的成果也促进形成了一整套新的高影响力期刊，如Sci Transl Med，Cancer Discov和Cancer Immunology Research。虽然没有人可以准确地预测研究将会通向哪里，但有一点是肯定的，癌症免疫治疗的未来确实是光明的。

参考文献：

Johnson LA, June CH.Driving gene-engineered T cell immunotherapy of cancer.Cell Res. 2017 Jan;27(1):38-58. 

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