利血平（Reserpine）是一种结构复杂的单萜吲哚生物碱（MIAs），具有多种药理活性，已作为抗高血压和抗精神病药物等治疗应用。其复杂结构激发了一代又一代合成化学家的广泛研究，并成功开发了多种创新合成策略。尽管如此，自然界组装这一复杂分子的生物合成逻辑仍然难以捉摸。
图1 | 利血平的结构特征、合成历史和生物合成途径
近日，
中科院深圳先进院合成所江寅迪研究团队
于
bioRxiv
在线发表了研究论文
Elucidation of the biosynthetic pathway of reserpine
，通过整合转录组挖掘、异源表达等方法，解码了萝芙木中利血平的生物合成途径，并成功重构了利血平生物合成中的关键中间体Rauvomitorine G。该研究促进了对复杂生物碱生物合成的理解，揭示了利血平生物合成的酶促逻辑，并为复杂分子支架的选择性功能化提供了重要的生物催化工具。
研究首先探讨了α-育亨宾（ α-Yohimbine，
2
）的生物合成途径，特别是其通过异胡豆苷（Strictosidine，
1
）途径转化为3-表-α-育亨宾（3-Epi-a-yohimbine，
4
）。利血平的β-构型与大多数MIAs的α-构型不同，而Vincoside和长春花甙内酰胺的β-构型提示Vincoside可能是利血平的前体，但具体转化过程未明。异胡豆苷是MIAs的共同前体，由异胡豆苷合成酶（STR）合成，经异胡豆苷葡萄糖苷酶（SGD）去糖基化后生成反应性亚胺中间体，进一步转化为多种吲哚生物碱。因此，研究提出了两种可能的生物合成途径：途径A通过未鉴定的SGD和MDR将Vincoside转化为
4
；途径B则通过STR、SGD和YOS酶将异胡豆苷转化为
2
，再通过差向异构酶将
2
的C-3位置翻转为
4
。
为了验证途径A
，研究化学合成了异胡豆苷和Vincoside的混合物，并在萝芙木转录组中鉴定出可能的Vincoside去糖基化候选基因，实验表明Vincoside不是
4
的来源。随后，研究通过在植物体内重构
2
来探索途径B。实验表明，共表达RvYOS、CrSTR和RvSGD的系统成功产生了
2
和
2a
。尽管RvYOS生成了
2
，但由于缺乏产物特异性，研究未能找到特异性生成
2
的酶，因此后续实验使用了
2
的化学标准品。
图3 | 参与 α-育亨宾差向异构化的酶的鉴定和表征
研究接着探讨了
2
向
4
的酶促差向异构化，假设该过程涉及
2
氧化为亚胺中间体3-脱氢-α-育亨宾(3-Dehydro-a-yohimbine，
3
)，再还原生成
4
。研究在萝芙木转录组中鉴定出了α-育亨宾氧化酶(RvYOO)，它能将
2
氧化为
3
。进一步通过3-脱氢-α-育亨宾还原酶（RvDYR）催化
3
生成
4
，表明 RvDYR 酶对 C3β 立体选择性的偏好。
在利血平生物合成的下一阶段中，涉及在C11和C18位置的两次羟基化以及在O11和O17位置的两次甲基化。从萝芙木中分离出的18β-羟基-3-表-α-育亨宾(18β-Hydroxy-3-epi-a-yohimbine，
5
)和Rauvomitorine G(
9
)表明，C18位置的立体专一性羟基化先于C11位置的甲氧基化。由于缺乏已知的C18羟化酶，研究通过共表达分析策略，以RvDYR1为诱饵，基于上游生物合成基因表达模式的相似性和高相关性筛选出了30个P450酶进行功能鉴定。
图4 | 发现和表征负责C11和C18羟基化和O甲基化的酶
瞬时表达RvCYP71D820在烟草中产生了预期的羟基化产物，并通过酵母微粒体组分验证。质谱分析确认羟基化发生在吲哚环外，产物身份通过化学合成标准品验证。这些结果确立了RvCYP71D820是负责
4
的立体专一性C18羟基化的酶，完成了利血平E环中五个连续手性中心的构建
。
研究接着寻找负责化合物
5
的C11甲氧基化的氧化酶和甲基转移酶。通过共表达分析策略，筛选出了与RvDYR1共表达的P450候选基因。其中，RvCYP72A270与RvCYP71D820共表达在烟草中产生了与合成的11,18β-二羟基-3-表-α-育亨宾(11, 18β-Hydroxy-3-epi-a-yohimbine，
6
)共洗脱的产物。进一步筛选发现，只有Rv11OMT能催化
6
形成
9
。最后，RvCYP71D820、RvCYP72A270和Rv11OMT的共表达成功产生了
9
，证实了这些酶在途径中的顺序活性。
在RvCYP72A270和RvCYP71D820共表达时，研究观察到一个与化合物
5
具有相同质量但保留时间不同的小峰。MS/MS分析表明吲哚环上发生了羟基化。因此，研究提出RvCYP72A270也可能氧化4形成11-羟基-3-表-α-育亨宾(11-Hydroxy-3-epi-a-yohimbine，
7
)。在烟草中表达RvCYP72A270并处理
4
后检测到
7
，证实了这一假设。基于Rv11OMT已知能甲基化
6
的C11羟基，研究接着探索了其对
7
的活性。RvCYP72A270和Rv11OMT共表达产生了对应甲氧基衍生物(
8
)的产物峰。这些发现表明从
4
到
9
可能存在一个分支途径，增加了生物合成途径的复杂性。
根据研究的生物合成假设，下一步是
9
的C17羟基O-甲基化以产生利血平酸甲酯(Reserpic acid methyl ester，
10
)。尽管研究尝试通过共表达分析鉴定相关的C17O-甲基转移酶，但未发现具有此活性的候选酶。这可能与
9
中C17羟基的高pKa值有关，使其不易形成适合甲基化的氧阴离子。
最后一步是将TMB基团转移到
10
上，研究推测这一过程可能涉及UGT和SCPL酶的催化。研究鉴定了能够催化TMBA糖基化的UGT酶，但在SCPL介导的酰化步骤中，尽管共表达了多个候选基因，仍未检测到利血平的形成。这可能是由于SCPL酶在异源宿主中翻译后修饰的复杂性。这些步骤的挑战表明，可能需要优化表达条件或使用更接近天然细胞环境的表达系统。
在烟草中重建Rauvomitorine G(
9
)时，研究过表达了从STR到Rv11OMT的八个基因，并添加色胺和裂环马钱子苷作为底物。LC-MS分析显示，仅检测到微量的
3
、
4
、
5
和
9
。
9
的生产效率可能因生物合成途径过长和某些酶（特别是RvYOS）的低效而受到显著影响。
图5 | Rauvomitorine G生物合成的重建
为了更好地验证整个途径，研究将途径分为两段分别验证：从色胺和裂环马钱子苷到
2
的第一段，以及从
2
到
9
的第二段。单独测试时，两段都表现出显著提高的性能。第一段包含CrSTR、RvSGD和RvYOS，成功产生了
2
。同样，第二段包含RvYOO、RvDYR1、RvCYP72A270、RvCYP71D820和Rv11OMT，有效地将外部供应的
2
转化为
9
。这些结果证实了所有生物合成步骤的功能，并表明通过蛋白工程优化RvYOS和平衡表达途径基因等途径优化策略可以提高
9
的总产量。
本研究揭示了萝芙木中利血平的生物合成途径，解决了天然产物化学的一个难题，不仅增进了对复杂生物碱生物合成的理解，也为生产利血平和相关药物化合物的代谢工程提供了基础，同时为开发新的化学酶法提供了可能。
资料来源：
https://doi.org/10.1101/2025.01.23.634628
