干湿结合一区思路，加味补中益气汤通过kisspeptin-GPR54-AKT-SHBG通路改善多囊卵巢

方法

结果

目的： 通过生理和生化参数检测、HE染色等分析JWBZYQ对PCOS大鼠体重、卵巢形态和功能的影响。

结果：

1. 采用TP和HFD建立肥胖PCOS大鼠模型并按图1A方案进行实验；

2. TP和HFD给药明显导致大鼠体重过重和发情周期中断，但WBZYQ和二甲双胍处理可改善该状况（图1B-E）；

3. JWBZYQ处理的大鼠血清中睾酮（T）和黄体生成素（LH）水平降低，SHBG水平升高，表明JWBZYQ能够改善激素失衡（图1F-H）；

4. HE染色显示，JWBZYQ处理组大鼠卵巢囊肿减少，卵巢形态更接近正常对照组（图1I）。

目的： 通过IF、血清kisspeptin水平测定和WB分析JWBZYQ对PCOS大鼠模型中kisspeptin和GPR54过表达的影响。

结果：

1. PCOS大鼠模型中ARC、肝脏和胰腺中kisspeptin和GPR54的表达相比对照组显著增加，而JWBZYQ治疗能够显著降低这些器官中kisspeptin和GPR54的过表达（图2A-I）；

2. PCOS大鼠血清中kisspeptin水平升高，JWBZYQ治疗能够降低血清中kisspeptin的水平（图2M）。

目的： 通过微生物分析研究JWBZYQ对PCOS大鼠肠道微生物菌群平衡的恢复作用。

结果：

1. 16S RNA测序结果显示，与对照组相比，PCOS模型组相比对照组有更低的肠道微生物多样性，而JWBZYQ处理能够部分恢复这种多样性，二甲双胍则似乎无效（图3A，B）

2. PCoA图显示对照组和其他组之间肠道菌群组成存在明显差异（图3C）；

3. 热图谱和群落条形图分析突出了各组粪便微生物群落组成的显著差异（图3D-F）；

4. 在PCOS模型组中，与kisspeptin和GPR54表达相关的特定细菌（如Prevotella，Ruminococcus，Oscillibacter 和 Eubacterium）的丰度发生了变化，JWBZYQ处理能够逆转这些变化（图3G-J）

目的： 通过网络药理学分析探讨JWBZYQ如何通过影响特定的生物分子和信号通路发挥作用。

结果：

1. 通过交集分析确定了151个JWBZYQ和PCOS共有的潜在靶点，并利用Cytoscape构建了药物-化合物-靶点-疾病（D-C-T-D）网络，显示了JWBZYQ可能通过多个靶点和信号通路对PCOS发挥作用（图4A-C）；

2. 基于STRING数据库构建这些共有靶点的PPI网络，发现JWBZYQ可能通过影响如TP53，AKT1，IL6，IL1B，TNF等关键蛋白发挥作用（图4D）；

3. GO和KEGG富集分析结果显示，JWBZYQ可能通过影响激素反应、细胞对脂质的反应、膜筏、受体复合体等生物学过程和信号通路，如癌症通路、PI3K-AKT信号通路、AGE-RAGE糖尿病并发症信号通路等（图4E，F）。

目的： 研究JWBZYQ对PCOS大鼠肝脏中SHBG表达的影响，以及其对PI3K-AKT信号通路的调节作用。

结果：

1. 与对照组相比，PCOS模型组中β-arrestin 2、P-AKT s473、PPAR-γ和HNF-4α的蛋白表达水平升高，而SHBG蛋白表达降低。JWBZYQ治疗能够显著降低β-arrestin 2和P-AKT s473的蛋白水平，并提高SHBG的蛋白表达（图5A-J）；

2. 在mRNA水平上，JWBZYQ治疗对PPAR-γ、HNF-4α、COUP-TF1和SHBG的表达有一定的调节作用，尽管这种调节并不完全与蛋白水平的变化一致（图5K-N）。

目的： 使用LC-MS/MS技术对给药后血清中的化合物进行鉴定和表征。

结果： 通过LC-MS/MS分析，成功鉴定了JWBZYQ进入血液后的多种化合物，包括（+）-isorangiformic酸、Byakangelicin、DTXSID50460857、perenniporide D、tetradeca2E,4E,6E,10E-四烯-8-炔酸哌啶衍生物、11-Keto-beta-boswellic酸、beta-Elemonic酸、3-羟基-2-预尼基-8,9-亚甲基二氧代苯并[4,5]呋喃[3,2-c]色酮-6-酮|buteaspermin A、Gilvsin B、Rubioncolin B、大豆皂甙分数B1、Atractyloside A等（图6）。

目的： 通过CCK-8细胞活力测试和SHBG蛋白表达分析确定JWBZYQ在体外实验中的最佳药物剂量。

结果：

1. CCK-8和WB试验结果显示，HepG2细胞活力随着kisspeptin54剂量的增加而降低，特别是在高于100 nM的剂量时，因此选择了80 nM的kisspeptin54用于后续建模（图7A-C）；

2. JWBZYQ在超过25%的浓度时会降低HepG2细胞的活力，因此选择了10%和20%的JWBZYQ用于低剂量和高剂量处理（图7D-F）；

3. SHBG蛋白表达分析结果显示，20%的JWBZYQ处理显著提高了SHBG蛋白水平，因此认为20%为最佳浓度（图7G，H）。

目的： 探究JWBZYQ对于由kisspeptin54引发的SHBG合成减少的抑制作用。

结果：

1. kisspeptin54处理导致HepG2细胞中P-AKT s473、PPAR-γ和HNF-4α蛋白水平升高，SHBG蛋白水平降低，而JWBZYQ和AKT磷酸化抑制剂MK-2206 2HCL处理能够明显逆转这些变化（图8A-F）；

2. 除此之外，AKT磷酸化激活剂SC79削弱了JWBZYQ的治疗效果。