点评 | 张明杰（中国科学院院士）、曹晓风（中国科学院院士）、俞立（清华大学）、李丕龙（清华大学）多囊泡体（MVBs）是细胞内的重要细胞器，在细胞质量控制中扮演着关键角色。MVB膜通过内陷和切割形成腔内小泡（ILVs），负责分选蛋白质货物，这一过程按当今的理解需要ESCRT蛋白复合体消耗ATP来完成【1】。近些年研究显示，生物分子凝聚体是细胞行使其功能必不可少的介观结构，通过多种多样的机制发挥作用。凝聚体可以与膜相互作用发生“润湿（wetting）”并引发毛细（capillary）现象【2】。然而，润湿相关毛细力在细胞过程中的生物学意义仍然知之甚少。2024年10月9日，清华大学方晓峰实验室与合作者在Nature杂志在线发表了题为Biomolecular condensates mediate bending and scission of endosome membranes的研究论文，揭示了植物蛋白FREE1相分离形成凝聚体，通过润湿作用诱导内体膜的内陷和不稳定性，足以在不依赖ESCRT机器和ATP的情况下介导ILV的形成。Nature杂志同期以Research Briefing的形式对该工作进行了题为Cell membranes shaped and cut by phase-separated liquid protein condensates的报道。方晓峰实验室专注于研究相分离形成的凝聚体在植物感知、应答和记忆环境胁迫中的作用机制（实验室正在招聘对此方向感兴趣的博士后人员）。研究人员首先利用实验室之前建立的相分离蛋白筛选体系【3】，发现植物ESCRT组分FREE1在体内和体外都具有很强的相分离能力，其N端内在无序区域（IDR）是驱动相分离的主要元件（图1）。此外，FREE1具有FYVE结构域，能够与膜脂质磷脂酰肌醇3-磷酸（PI3P）结合，从而定位到MVB膜上。进一步研究发现，凝聚体的形成显著增强了FREE1与膜的结合能力，且FREE1凝聚体作为支架，招募ESCRT其它组分进入其凝聚体，增强它们与膜的结合能力。很重要的是，作者发现利用序列完全不同的FUS-IDR替换FREE1的IDR，能够完全回补free1突变体致死的表型（图1）；而失去了相分离能力的FUS-IDRm则不能，表明FREE1的相分离是其发挥功能必要且充分的条件。然而，作者发现FUS-IDR-FREE1虽然可以替代FREE1的功能，但不能与ESCRT相互作用从而招募它们进入其凝聚体中，暗示FREE1的凝聚体可以独立于ESCRT发挥功能。图1. FREE1相分离是其发挥功能所必需的。（a）不同形式FREE1蛋白的结构示意图；（b）不同形式FREE1体外相分离实验；（c）所示基因型植物的发育表型。
进一步，研究团队通过体外重构和计算机模拟FREE1凝聚体与膜的相互作用，发现FREE1凝聚体可以在极短的时间内使得膜发生弯曲内陷。在体外重构实验中，研究者观察到在没有ESCRT复合体存在的情况下，FREE1凝聚体填充的小膜泡可以在大膜泡GUV内侧形成并在内部自由扩散（图2），表明FREE1凝聚体本身足以介导囊泡剪切。物理理论计算发现支持这一猜测。作者进一步提供了很强的遗传学证据：在缺失ESCRT的植物中过表达可以形成凝聚体的FUS-IDR-FREE1，发现能够很大程度上实现MVB内ILV的形成。最后研究者还发现，尽管可以相分离但不招募ESCRT的FUS-IDR-FREE1能够满足植物在正常条件下的生长发育，但不能满足植物在高盐和干旱等条件引起的渗透胁迫下的萌发和存活率，说明ESCRT蛋白机器和FREE1凝聚体可能是进化过程保留下来的实现MVB产生的双保险机制，也能够更好地应对环境的变化。胁迫条件下这两种机制如何相互协同还有待未来进一步研究。
图2. 多手段揭示FREE1凝聚体与膜的相互作用。（a）体外FREE1液滴（紫色）与GUV膜（绿色）的相互作用；（b）计算机模拟液滴（紫色）通过浸润内陷膜（绿色）的动态过程；（c）物理理论计算膜颈切割所需的力与液滴大小之间的关系。
综上，此研究揭示了一种不同于传统认知的、由ESCRT机器消耗ATP介导的、MVB产生的新机制：FREE1相分离形成的具有液态属性的凝聚体，通过其产生的毛细力驱动MVB膜内陷，引起膜颈的不稳定进而完成膜的剪切形成ILV，该过程不依赖ESCRT机器和且不ATP消耗（图3）。这一研究极大地拓宽了相分离在生物学中功能研究的维度，加深了我们对细胞内膜系统重塑的理解。
图3. 凝聚体介导ILV形成的工作模型。左边显示传统认为的通过ESCRT蛋白机器与ATP酶协同实现ILV产生的过程；右边显示本研究发现的凝聚体通过毛细力内陷MVB膜和对膜颈的切割实现ILV产生的过程。
清华大学生命科学学院方晓峰副教授和德国科隆大学Roland Knorr教授为该文通讯作者，清华大学生命学院博士后王艳宁、李树林和德国弗莱贝格工业大学的Marcel Mokbel博士为该文共同第一作者。东京工业大学Alexander May博士、弗莱贝格工业大学Sebastian Aland教授、伦敦大学学院Jaime Agudo-Canalejo教授、香港中文大学姜里文教授及其课题组梁子臻博士、中国科学院华南植物园曾咏伦研究员和清华大学葛亮副教授等人对该工作作了重要贡献。细胞膜系统的重塑包括出芽和内陷，对细胞生命活动至关重要。膜内陷发生在细胞分裂、内体成熟、自噬、膜修复等多种生物学过程中，通常由ESCRT蛋白机器介导。ESCRT蛋白与ATP酶协作，消耗ATP驱动膜的切割或闭合。ESCRT介导内体（endosome）膜内陷形成多囊泡体（multi-vesicular body, MVB）是真核生物中高度保守的过程，在细胞器生成、蛋白质降解、病毒出芽等过程中发挥重要作用。FREE1是植物中ESCRT复合体的一个组分，之前的研究表明其参与MVB的形成，但确切功能和机制尚不完全清楚。方晓峰实验室建立了以解析生物凝聚体参与植物对环境胁迫感知、应答和记忆的研究体系，系统地筛选和探究相分离蛋白的特性及其在植物胁迫响应过程中的生理功能。他实验室最新的一项研究发现ESCRT蛋白FREE1具有极强的液-液相分离能力且遗传证据显示相分离能力是FREE1发挥功能必要且充分的条件。进一步研究显示FREE1凝聚体定位在MVB的外膜上，通过招募ESCRT组分促进它们在膜上的富集。非常有意思的发现是，破坏FREE1招募ESCRT组分的能力但是保留其相分离的能力就足以实现正常生长条件下MVB的形成。作者提出大胆假设：FREE1的凝聚体可以通过与膜的相互作用，直接驱动MVB膜的内陷和切割形成内腔小泡，而不依赖ESCRT蛋白和ATP消耗。要证明这一假设是不容易的，方晓峰研究团队与材料物理学和计算生物学方面的专家展开合作，通过体外重构、计算模拟、物理理论研究和遗传学等手段，为这一现象提供了强有力的证据。这项研究非常好地展示了多学科交叉在生物学研究中的重要性，尤其是相分离与相变在生物学中的作用机制研究上，tei特别需要结合物理、化学、数学及其它学科，才能真正理解相分离的意义和机制，这种学科的交叉融合也应该是我们国内研究领域所应该进一步鼓励和发展的。方晓峰实验室的发现也提示蛋白质凝聚体通过润湿作用有可能更广泛地作用于细胞中囊泡的内吞和外吐，他们的研究也为未来进一步探究生物凝聚体与细胞内其它结构互作提供了借鉴和理论基础。曹晓风（中科院遗传与发育生物学研究所研究员、中国科学院院士）清华大学方晓峰实验室最新一项研究发现植物细胞内FREE1蛋白相分离形成凝聚体，通过其物理属性，即毛细力，即可实现对细胞内膜系统的重塑，这个过程不依赖我们传统认知的蛋白质机器且不需要消耗ATP。这项研究产生了原创的重要理论，是对生物学研究知识边界的一次勇敢探索。很显然这样的机制不止存在于植物的多泡小体（MVB）的形成过程，对其它物种中膜重塑过程的研究具有重要的借鉴。往往来源于植物中的科学发现容易被科学界，尤其是动物学研究领域所忽视，但我相信方晓峰团队的这一来源于模式植物拟南芥的研究发现，能够为动物研究领域提供非常好的启示。另外，这项研究为真正的基础科学研究作了一个示范，希望国内从事基础科学研究的青年科学家能够深度钻研具有挑战的科学问题，善于利用学科交叉手段解决问题。细胞内膜系统动态变化的研究，起源于George Palade的开创性工作。每一次对内膜动态变化与组织方式的新认识，都会催生出大量的新发现。回顾近十年来细胞生物学的重大进展，回归生理与数理交叉为重要特点。前者尤其依赖内膜系统的动态变化，而后者则涌现了以相分离（phase separation）为基础的新颖机制。例如，南方科技大学张明杰团队的研究揭示了相分离机制在短距离的运输中的关键作用，揭示了一种无能量依赖的定向运输方式。生物大分子相分离作为一个重要的研究领域，引起了科学界的广泛关注，尤其是在膜重塑和物质运输过程中，相分离的生理意义和机制亟待深入探究。清华大学的方晓峰研究团队与合作者在近期的研究中揭示了植物内体分选复合物（ESCRT）组分FREE1如何通过液态凝聚体的形式，驱动腔内囊泡（ILV）的形成。这一发现对多囊泡体（MVB）形成机制的理解具有重要意义。研究显示，FREE1凝聚体不仅能够独立地介导膜的弯曲与分裂，且在缺乏ATP和ESCRT蛋白的情况下，仍能有效完成腔内囊泡的形成，该过程在哺乳动物细胞中同样保守。这一机制的提出，为我们理解膜的动态变化提供了全新的视角，揭示了相分离在膜重塑过程中的关键作用。该研究的另一个重要贡献在于对膜的物理特性与动态过程之间关系的阐述。研究者通过物理模型与计算模拟，展示了相分离凝聚物如何通过湿润效应（wetting）引导膜颈部的分裂。这一发现不仅加深了我们对膜分裂机制的理解，也强调了生物大分子相分离在细胞运输中的广泛应用潜力，特别是在应对细胞内环境变化时，凝聚物的动态调控显得尤为重要。自Scott Emr教授在2001年发现了首个ESCRT复合体以来，一系列的研究揭示了ESCRT途径及其在细胞蛋白质分选、细胞分裂、病毒逃逸等的重要机制。FREE1的相分离与ESCRT蛋白的相互作用，可能为细胞内物质的选择性运输与代谢调控提供新的思路。随着对相分离机制的深入研究，未来我们有望揭示其在不同生理条件下的多样化功能，为疾病防治与生物技术的应用提供新的方向。可以预见，这一领域将继续推动细胞生物学的发展，助力我们揭示生命活动的本质与机制。在细胞中，生物大分子可以通过多价相互作用与周围基质发生液-液相分离，从而形成富集特定蛋白和核酸的功能性液态凝聚体。近年来，蛋白凝聚体的功能研究蓬勃发展，揭示了其在细胞信号转导、基因调控以及蛋白降解等多种生物过程中广泛参与和显著的优势。一方面，相分离依赖的蛋白招募和高度富集有助于促进分子间相互作用并减少背景蛋白的干扰，从而保证内部生化反应特异高效地进行，实现对细胞内外环境变化的迅速响应。例如突触后致密区通过对膜上受体和信号转导分子的分类富集，实现信号的高效整合和传递（引用张明杰老师的一系列漂亮工作）。另一方面，液态凝聚体具有的力学性质，如表面张力和浸润效应等，可以在细胞活动中直接表现为机械力，介导细胞骨架网络组装等耗能过程。然而，相分离形成的蛋白凝聚体与传统分子复合物机器在功能上的关联性和独立性尚未得到充分阐明。ESCRT复合物是细胞中膜重塑，特别是多泡体（MVB）形成过程中的关键机制。它能够识别并招募泛素化标记的目标蛋白到MVB上，并通过组装形成螺旋状结构，将ATP水解释放的能量转化为MVB膜向内弯曲形成内腔囊泡（ILVs）并最终与外膜彻底分离的机械力。近日，清华大学生命学院方晓峰教授及合作者在Nature上发表的最新研究报道了拟南芥ESCRT相关蛋白FREE1通过相分离形成的凝聚体介导MVB中ILVs的形成。FREE1依赖其N端的IDR在MVB膜上形成凝聚体，并通过毛细作用和浸润作用克服膜弯曲所需的能量壁垒，向内出芽形成ILVs。FREE1凝聚体具备招募ESCRT组分的能力，但值得关注的是，其招募泛素化蛋白及形成ILVs的过程并不依赖于ESCRT复合物，且拟南芥中ESCRT功能丧失造成的表型缺陷可以通过增强FREE1凝聚体形成进行回补。这些发现充分表明了依赖液-液相分离形成的蛋白凝聚体具有独立于已知的分子复合物机器执行细胞功能的能力，并为其他细胞活动的机制研究在现有的理论框架之外提出了新的可能，为领域注入了新的活力。前苏联生化学家Alexander Oparin在1936年出版的《生命的起源》一书中提出，生命起源于有机物质凝聚的液滴。受当时科学水平的局限，这一理论并未能解释液滴自发凝聚的机理和功能。而在近一个世纪后的今天，关于液-液相分离的驱动力和液滴物理性质的基础理论研究以及生物体中相分离依赖的功能研究成果日益丰硕，提示着原始生命可能依赖多价互作形成的生物大分子凝聚体进行基本生命活动。方晓峰及合作者这项最新研究成果进一步暗示了这一点，且鉴于蛋白凝聚体能够介导内膜系统重塑，早期膜系统演化可能也有凝聚体的参与。此外，这项工作还发现，虽然在正常状态下仅凭FREE1凝聚体就能满足植物的生存需要，但在高渗环境下，只有FREE1凝聚体和ESCRT复合物两条途径相互作用，协同介导MVB形成，植物才能正常生存并繁殖。这也暗示在原始生命向高等生命进化的过程中，由于需要适应复杂多变的环境，逐渐演化出液态凝聚体和分子复合物机器协同作用的机制，二者各自可以独立行使功能，并在复杂环境下相互促进和补充，共同保证生命活动的正常进行。https://www.nature.com/articles/s41586-024-07990-0制版人：十一
1. Vietri, M., M. Radulovic, and H. Stenmark, The many functions of ESCRTs. Nat Rev Mol Cell Biol, 2020. 21(1): p. 25-42.2. Gouveia, B., et al., Capillary forces generated by biomolecular condensates. Nature, 2022. 609(7926): p. 255-264.3. Zhang, H., et al., Large-scale identification of potential phase separation proteins from plants using a cell-free system. Mol Plant, 2023. 16(2): p. 310-313.
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