我的博士生师弟，回实验室只想知道他年前是干啥的……看来他只能靠读文献，来恢复记忆了！今天这篇文章挺有意思，讲的是急性肾损伤后，巨噬细胞自噬诱导的蛋白降解。这篇文章就是广东医科大学附属医院刘华峰团队，发表在14.6分的Autophagy上的文章。他们是通过筛选后，发现了巨噬细胞通过自噬，降解了激活炎症的TARM1这个蛋白（当然，这样的自噬应该就不能算是巨自噬了，仅是通过内吞作用降解部分蛋白的过程，不清楚自噬信号通路的话，可以先去看看《信号通路是什么鬼？》系列的自噬相关章节复习一下）。我们就来看看他们是怎么做的吧：
他们通过测序数据发现，在AKI（急性肾损伤）发生后，AKI小鼠的巨噬细胞中，自噬相关基因相比于假手术的小鼠得到了富集，以此判断，可能在AKI发生后，小鼠的巨噬细胞中产生了自噬（这其实就是归纳法中米勒五法的求同求异法，通过大量数据来分析AKI小鼠及假手术小鼠之间基因表达的差异，与其表型相互绑定，不清楚归纳法和米勒五法的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》）。于是他们就重点关注了AKI小鼠巨噬细胞的自噬情况，通过LC3的荧光染色，他们发现AKI小鼠巨噬细胞中的确发生了自噬。而在不同的AKI模型中（IR，即缺血再灌注诱导的AKI，与IFNγ+LPS诱导的AKI），巨噬细胞都存在有这样的自噬增多的现象：
于是他们构建了一个ATG5特异性缺陷的巨噬细胞小鼠，也就是巨噬细胞自噬缺陷的小鼠。通过这个，他们想要来验证巨噬细胞的自噬，对于AKI的具体影响（这就是柯霍氏法则的验证，通过移除可能的关键因素，来分析该因素对于表型的关联性，在这里就是抑制巨噬细胞自噬的形成，来分析巨噬细胞自噬对于急性肾损伤的影响，不清楚柯霍氏法则的话，可以去看看《轻松的文献导读》和《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》）。结果发现巨噬细胞的自噬缺陷，会导致小鼠的急性肾损伤加剧，发展成更为严重的急性肾损伤：
而另一方面，自噬缺陷的巨噬细胞，在诱导急性肾损伤后，会表达更多的炎性因子，促进小鼠的肾脏炎症：
于是他们对假设进行了迭代，假设是由于巨噬细胞自噬抑制炎症反应，保护了小鼠急性肾损伤（假设的迭代，就是在已知的信息基础上，对于原有的假设进行迭代更新的过程，现有的证据能证明巨噬细胞的自噬缺陷诱导了炎症的发生，那么自噬可能就是可以抑制这些炎症因子的关键，通过迭代假设，才能更好地推进课题，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。于是他们使用了CL（氯膦酸盐脂质体）清出了AKI小鼠中的巨噬细胞，然后分别移植入野生型的巨噬细胞和自噬缺陷的巨噬细胞。结果发现自噬缺陷的巨噬细胞，的确能加重小鼠的AKI症状，及炎症反应：
那巨噬细胞的自噬到底影响了哪些蛋白表达，才导致了这些表型呢？通过对自噬缺陷的巨噬细胞进行了组学分析，他们发现TARM1在自噬缺陷的巨噬细胞中表达明显升高。而敲减TARM1或者使用竞争性的FC融合蛋白，都能抑制IFNγ+LPS诱导的自噬缺陷巨噬细胞中炎症因子表达。由于TARM1能结合SYK，而SYK可以激活NFκB信号通路，从而激活炎症因子转录。于是他们使用了SYK抑制剂以及NFκB信号通路抑制剂来进行了验证，实际上这样的验证并不够严谨（通过这样的下游通路的抑制剂验证，虽然能得到对应的结果，但由于并非直接证据，可能就会造成肯定后件的逻辑谬误，不清楚肯定后件逻辑谬误的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
那么既然TARM1能影响炎症因子的表达，那是否TARM1的表达，会收到自噬的调控呢？于是，他们分别使用了几种不同的自噬抑制剂进行验证，确定了TARM1在自噬被抑制后，蛋白表达的增加：
之前有研究表明，细胞膜受体在被泛素化后，会被转运到内体，然通过自噬降解。那么TARM1如果是通过自噬降解的，那应该还会存在有泛素化的这一个过程，而泛素化的过程，必然要涉及E3泛素化连接酶（泛素化也是蛋白的一种比较重要的修饰方式，通过E3泛素化连接酶对赖氨酸进行泛素化修饰，不熟悉泛素化信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）。于是他们通过筛选，找到了可以结合TARM1的E3泛素化连接酶，MARCHF1和MARCHF8，当这两个E3连接酶功能区域突变后，则无法诱导TARM1的泛素化。同时，这两个E3泛素化连接酶被敲减后，也同样会影响急性肾损伤后炎症因子的表达：
刚刚也提到细胞膜受体在被泛素化后，会被转运到内体，也就是内吞。于是他们就通过荧光共定位，分析了TARM1是否在泛素化后进入到了内体。在这里他们对TARM1的两个泛素化的赖氨酸位点进行了突变，明确了没有泛素化修饰的TARM1无法进入内体（这里的验证其实是这篇文章中比较严谨的部分），而泛素化是TARM1内吞作用所必需的：
那进入内体后，泛素化修饰的蛋白，是需要被类似p62这样的自噬受体蛋白结合之后，才会进入自噬体的。于是他们通过免疫共沉淀及免疫荧光的共定位，发现TARM1可以与TAX1BP1、p62和NBR1相互结合。结合后，形成了自噬体，最终导致了蛋白的降解。在缺乏TAX1BP1、p62的情况下，TARM1则无法被降解（下图WB的弥散带就说明了这一点）：
最后，就形成了这样的示意图，IFNγ+LPS诱导的急性肾损伤，激活了TARM1，TARM1在巨噬细胞中通过MARCHF1和MARCHF8这两个E3泛素化连接酶，促进了泛素化，并被内吞进入内体。内体中的泛素化TARM1被TAX1BP1、p62识别，进入自噬体，并被降解。而在自噬缺陷的巨噬细胞中，TARM1会通过SYK→NFκB信号通路，激活炎症因子转录，加重急性肾损伤：
这篇文章思路是比较清晰的，通过对巨噬细胞自噬的验证，逐渐挖掘出了TARM1这个蛋白，以及其对炎症因子的激活。但是美中不足的是，在部分验证中，比如在TARM1下游的炎症因子激活的相关通路中，还是有点逻辑漏洞。在E3泛素化连接酶的验证过程中，也存在着肯定后件的逻辑谬误。不过总的来说，这篇文章的推进和假设的迭代，都还是不错的。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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