在 PubMed 检索文献时，夏老师留意到不少与巨噬细胞相关的研究，其中巨噬细胞和中性粒细胞之间的相互作用（Crosstalk）是一个极具研究价值的方向。例如，南昌大学第一附属医院发表在影响因子 11.4分 的《Redox Biology》上的这篇文章就十分有趣，它主要探讨了 Tim3 巨噬细胞对中性粒细胞坏死性凋亡的抑制作用（关于坏死性凋亡，在《信号通路是什么鬼？》系列中有详细讲解，感兴趣的可以去看下） 。
首先，Tim3 即 T 细胞免疫球蛋白结构域和粘蛋白结构域 3，它是 Th1 细胞的标志物，在巨噬细胞中也有表达，然而 Tim3 巨噬细胞在肠炎中的具体作用尚未明确。中性粒细胞作为免疫防御的第一道防线，在机体免疫中发挥着重要作用，但在炎症性肠病（IBD）患者中，中性粒细胞的过度募集会导致组织损伤。这篇文献首先对 IBD 样本中的细胞亚群展开分析，通过单细胞测序（如 UMAP 图所示，这种图和 tSNE 图类似，在《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》中都有介绍，感兴趣的读者可以回顾相关内容），研究人员发现 IBD 患者结肠的巨噬细胞中，Tim3 的表达呈现上调趋势。
为了进一步探究 Tim3 在巨噬细胞中的功能，研究人员运用 Cre - LoxP 系统对小鼠巨噬细胞的 Tim3 进行敲除。在使用 3% 葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导小鼠肠炎后，研究人员发现 Tim3 巨噬细胞特异性敲除的小鼠炎症反应增强。这表明巨噬细胞中的 Tim3 能够使小鼠抵抗 DSS 诱导的结肠炎症。
由于 Tim3 巨噬细胞特异性敲除后出现炎症增强的现象，研究人员对敲除后的炎症分子表达进行了检测。结果显示，在 DSS 诱导后，Tim3 巨噬细胞特异性敲除的小鼠体内，炎症分子和趋化因子的表达显著增加。巨噬细胞 Tim3 的缺失明显增强了结肠炎期间 M1 极化的巨噬细胞以及结肠中性粒细胞的浸润。
巨噬细胞特异性 Tim3 缺失导致更多细胞聚集。通过 RNA 测序及测序结果的基因集富集分析（GSEA），研究人员发现，DSS 处理的 Tim3 巨噬细胞特异性敲除小鼠显著富集了细胞对肿瘤坏死因子通路的反应以及炎症引发的坏死性凋亡。RIP1、RIP3 和 MLKL 是坏死性凋亡的关键基因（关于这几个基因的介绍，可查阅《信号通路是什么鬼？》系列中坏死性凋亡的相关章节）。于是，研究人员进一步分析了这三个蛋白的激活状态，结果发现巨噬细胞特异性 Tim3 缺失会诱导肠道坏死性凋亡。
那么，巨噬细胞特异性 Tim3 缺失在 DSS 诱导后，是否是通过坏死性凋亡导致肠道炎症加剧的呢？研究人员在 DSS 诱导后，使用 RIP1 或 RIP3 的抑制剂进行验证（这是对柯霍氏法则的应用，具体内容可查看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》《轻松的文献导读》或者《列文虎克读文献》）。结果表明，对 RIP1 或 RIP3 进行药理学抑制，能够缓解巨噬细胞特异性 Tim3 敲除小鼠中 DSS 诱导的结肠炎。
既然巨噬细胞特异性 Tim3 缺失会诱导坏死性凋亡，那么究竟是哪种细胞发生了坏死性凋亡呢？研究人员对细胞标志物和 p - MLKL 进行荧光双染色，结果显示，巨噬细胞中特异性敲除 Tim3 后，主要是 Ly6G 中性粒细胞表达了 p - MLKL。这意味着巨噬细胞特异性敲除 Tim3 后，会诱导中性粒细胞发生坏死性凋亡。
接下来，研究人员探究 Tim3 缺陷的巨噬细胞与中性粒细胞相互作用的机制。通过共培养实验和小室的 Transwell 实验，发现 Tim3 缺陷的巨噬细胞能够诱导中性粒细胞的趋化性，且 Tim3 缺陷的巨噬细胞的培养基也能诱导中性粒细胞的坏死性凋亡。这说明 Tim3 缺陷的巨噬细胞可能通过旁分泌的方式诱导中性粒细胞坏死性凋亡。
熟悉 TNF 信号通路的读者应该知道，TNF 信号通路会通过 TNFα/RIP1/RIP3/MLKL 激活坏死性凋亡（相关内容可查阅《信号通路是什么鬼？》系列中的 TNF 信号通路和坏死性凋亡信号通路章节进行复习）。IL8 是一种引导中性粒细胞进入炎症部位的趋化因子。研究人员通过 ELISA 分析了 Tim3 缺陷的巨噬细胞分泌的 TNFα 和 IL8 的量，结果显示，Tim3 缺陷的巨噬细胞的培养基上清液中，TNFα 和 IL8 水平显著升高。
那么，Tim3 缺陷的巨噬细胞中高表达的 TNFα 和 IL8 是如何产生的呢？熟悉炎性分子相关通路的读者应该知道 Toll 样受体信号通路和 NFκB 信号通路（若不熟悉，可回顾《信号通路是什么鬼？》系列中对这两条信号通路的详细讲解），这两条通路能够激活 TNFα 和 IL8 的表达。基于此，研究人员假设巨噬细胞中高表达的 Tim3 会通过抑制 Toll 样受体信号通路和 NFκB 信号通路来抑制炎症反应。实验结果证实，巨噬细胞中的 Tim3 确实下调了 TLR4/NFκB 信号的激活。
Tim3 巨噬细胞特异性缺陷的小鼠在 DSS 诱导后，结肠中会产生大量的活性氧（ROS）。为了明确 ROS 的产生与 Tim3 缺陷的巨噬细胞诱导的中性粒细胞坏死性凋亡之间的关系，研究人员使用了 ROS 的清除剂，发现 Tim3 缺陷的巨噬细胞诱导的坏死性凋亡在 ROS 清除后有所减弱。这表明 ROS 在 DSS 处理的 Tim3 巨噬细胞特异性缺陷的小鼠中，起着关键的致病作用。
坏死性凋亡会导致细胞产生大量的危险相关分子模式蛋白（DAMPs，关于 DAMPs 的相关知识，可查阅《信号通路是什么鬼？》系列里焦亡和坏死性凋亡的相关章节，焦亡和坏死性凋亡产生 DAMPs 的机制较为相似），这些 DAMPs 会引发肠道细胞的炎症反应。研究人员用 Tim3 缺陷的巨噬细胞上清诱导中性粒细胞坏死性凋亡，再用处理后的中性粒细胞的上清去处理肠道上皮细胞，结果发现肠道上皮细胞受到了损害。这表明 Tim3 缺陷的巨噬细胞和中性粒细胞在炎症期间的协同作用，可能会放大炎症反应，破坏肠道屏障。
最后，研究人员构建了这样一个示意图：
高表达 Tim3 的巨噬细胞会通过抑制 Toll 样受体信号通路和 NFκB 信号通路，降低 ROS 的产生，抑制 IL8 和 TNFα 的表达，从而减少 IL8 和 TNFα 激活中性粒细胞趋化性及坏死性凋亡的可能性，最终阻止中性粒细胞产生 DAMPs 加重炎症反应。这篇文章十分有趣，它从巨噬细胞的角度出发，逐步剖析 Tim3 高表达对肠道炎症的影响，进而聚焦于巨噬细胞与中性粒细胞之间的相互作用。通读整篇文献，我们可以深刻认识到学好信号通路的重要性。今天的分享就到这里，感兴趣的可以阅读原文，希望对大家有所帮助。
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