《微生物组测序与分析专家共识》涵盖从微生物采集与保存、DNA 提取建库、高通量基因测序和数据分析以及质控标准品等全流程、各环节的建议和标准。其中包含了对扩增子测序、元基因组、单菌基因组、转录组测序及数据分析各环节的操作方法、评价指标以及相应软件的介绍，今天小编就带大家来看看，关于单菌基因组测序与分析都有哪些衡量标准，看看你的基因组是否合格？
对分离纯化培养的单菌进行
DNA
提取、文库构建、测序和全基因组组装。单菌全基因组的从头组装
（
denovo
）
或重新组装的生物信息分析流程主要包括：序列质控、全基因组组装、基因组质量评估、基因注释和功能分析等（图
1
）。
图
1
.
单菌基因组测序生物信息分析流程图
在进行正式分析前，要先对下机数据进行质控。二代数据质控过程主要包括：移除低质量序列、过短序列、接头序列等，同时
移除连续低质量碱基
(
Q<20)
数大于
40%
的读序。
Pacbio
三代平台数据的过滤参考阈值如下：移除长度较短的读段
(≤500 bp)
和低质量的读段
(Mean Concordance>0.8)
。
Tips1
：二代测序中，每测一个碱基会给出一个相应的质量值（
Q
）用来衡量测序的准确度。如碱基的质量值
20
，表示该碱基被识别错误的概率为
10
-2
，即
1%
，
30
的错误率为
10
-3
，即
0.1%
。
Q20
与
Q30
则表示质量值
≧20
或
30
的碱基所占百分比。
Illumina
官方一般以
Q30
作为评价标准。
2、
全基因组组装
二代测序数据读长（
reads
）较短
(150–300 bp)
，无法跨越基因组中某些长于
reads
的重复序列区域，导致组装结果片段化，即形成大量长的
Contig
和
Scaffold
。结合三代测序长读序和二代测序高精度的优点，进行
“
三代加二代
”
的全基因组组装，即应用单分子测序的长读长进行最初的基因组组装，然后结合高精度的二代测序的短读序对组装的序列进行校正
(Polished)
，结果产生了更长的序列和更准确的功能注释。
常用的高通量基因测序平台的单菌组装软件有
SOAP denovo
或
SPAdes
等软件。二代
/
三代混合组装可应用
Unicycler
。三代组装软件有
Canu
、
HGAP
、
Falcon
或
SMRT Link
等软件。
“
三代加二代
”
组装时，可应用软件
bwa
比对高通量基因读序到矫正后的三代组装序列上，进行再校正，提高序列精度。
3、
基因组质量评估
组装后的单菌全基因组应进行标准的质量评估，建议遵从美国能源部联合基因组研究所
(DOE JGI) 发布的定义不明微生物基因组的MISAG标准。
相关文章
2017
年发表在《
nature biotechnology
》，《
Minimum information about a single amplified genome (MISAG) and a metagenome-assembled genome (MIMAG) of bacteria and archaea
》
MISAG(
单菌基因组标准
)
分别从组装质量（
assembly quaility
）、基因组完整性（
genome completeness
）、基因组污染率（
contamination
）三个方面进行量化评判（
table1
），文章同时也对各部分评估所用软件
/
工具进行了说明。
基因组组装质量评估可以参考
scaffold/ contig
的总数、
N50/N90
长度、最长
/
最短长度、序列中的
N
含量
(N rate)
和
GC
含量
(GC%)
等参数进行综合评估。细菌完成图可参考染色体是否成环
(gap=0)
。真菌精细图谱质量的质控参数为
N50>2M (
真菌
survey
的杂合率
<0.8)
。评估基因组组装的完整性和质量可应用基于保守基因集的
CEGMA
和单拷贝看家基因的
CheckM
等软件。（详情点击
“
阅读原文
”
获取）
4、
基因注释和功能分析
细菌编码基因的预测可应用
Glimmer 、Prodigal 和 GeneMarkS 等软件。非编码 RNA 的分析可应用 RNAmmer、Barrnap 或 tRNAscan-SE。其他基因组组分预测有：CRISPRFinder 和 PHAS等软件预测前噬菌体；RepeatMask 和 TRF (Tandem Repeats Finder) 等软件识别基因组的重复序列，功能预测可应用HUMAnN2 或 BLAST+。更多软件（功能说明及下载地址，点击文末“阅读原文”获取）。
参考文献：
1、
《
“
微生物组测序与分析专家共识
”
细则》；
2、
《微生物组测序与分析专家共识》；
3
、
Bowers, R., Kyrpides, N., Stepanauskas, R. et al. Minimum information about a single amplified genome (MISAG) and a metagenome-assembled genome (MIMAG) of bacteria and archaea. Nat Biotechnol 35, 725–731 (2017). https://doi.org/10.1038/nbt.3893
上海唯那生物科技有限公司于 2020 年 4 月在上海市奉贤区东方美谷生物科技园注册成立, 公司专注于提供生物科研过程中的周边服务，主要业务分为四个模块：
①
基因组学测序服务
，尤其是病原细菌、真菌、病毒的测序和数据的个性化深度加工挖掘；
②
生物科研技能培训服务
，包括生物信息学（生物科学和
IT 技术的结合）技能培训、生物
科研实验操作技能培训等，自主搭建了“密码子学院”这个行业性技术培训平台；
③
试剂耗材商城
，主要提供实验室科研人员开展研究过程中所需要的各类生物制剂、实验
消耗品等，自主搭建了“密码子商城”这个专注于实验室试剂耗材的专业类交易平台。
④
生物科研的云计算平台的开发和生物资源数据库平台的搭建
，以生物云的方式为不同水
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/
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（详情点击
“
阅读原文
”
获取）
