江南大学蒋航、香港中文大学魏涛等CCS Chemistry：微室化液滴厌氧发酵与分离，为益生菌/化妆品原料生产带来新契机

研究背景与挑战

在微生物制造领域，厌氧微生物的培养一直是备受关注且极具挑战性的课题。严格厌氧菌由于只能在无氧环境中生存，其培养面临诸多困难，但许多益生菌及化妆品有效核心成份都源于微生物厌氧发酵。传统的培养技术，如原始除氧、空气排除以及使用化学还原剂等方法，不仅需要操作人员具备大量的专业经验，而且其适用范围有限，无法满足所有厌氧菌的培养需求。厌氧罐和厌氧袋方法虽然在一定程度上能够创造厌氧环境，但在培养过程中对细菌的操作存在诸多限制，并且需要根据实际情况进行气体更换。而厌氧手套箱培养虽然是较为先进的技术，但设备和维护成本高昂，限制了其广泛应用。

近年来液滴作为微生物培养的微环境逐渐受到关注，其中 Pickering 乳滴更是展现出了独特的优势。然而，Pickering 乳液的高度稳定性却给细菌悬浮液的回收带来了巨大挑战，这成为了其在实际应用和广泛推广中的关键障碍。

创新方法与突破

研究团队通过一系列创新手段，成功开发出一种高效的厌氧微生物培养与分离方法。具体而言，他们在常规单分散聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PNIPAM）微凝胶表面进行了共价生长二氧化硅颗粒，并进一步实施原位疏水改性，从而获得了不同形态的疏水二氧化硅包裹的 PNIPAM 微凝胶（H-SiO₂@PNIPAM）。这种经过特殊处理的微凝胶展现出了卓越的性能，其能够在 37°C 时稳定油包水（w/o）Pickering 乳液。这一温度恰好与大多数细菌的最佳培养温度相吻合，为细菌的生长提供了适宜的环境。同时，乳液中的油相起到了至关重要的作用，它能够有效地隔离氧气，为厌氧菌创造出理想的厌氧空间，极大地促进了厌氧菌的高效生长。

图1. 研究工作示意图

而该研究最为关键的创新点在于乳液相反转。当培养过程结束后，通过降低温度这一简单操作，会引发微凝胶颗粒一系列的物理化学变化。微凝胶颗粒会迅速溶胀，并且其表面性质从疏水转变为亲水。这种性质的转变直接导致了乳液类型的立即转化，经再次乳化可实现从油包水（w/o）转变为水包油（o/w）。

图2. 微凝胶界面吸附与智能Pickering乳液相反转

详细来说，在 w/o 乳液状态下，微凝胶颗粒稳定地分布在油水界面，使得乳液保持稳定的结构。而当温度降低时，微凝胶颗粒的亲水基团开始发挥作用，它们与水分子之间的相互作用增强，最终实现了从 w/o 到 o/w 的彻底转变。这种乳液相反转的过程具有极高的效率和可控性。它使得细菌悬浮液能够在不受到任何损伤或损失的情况下，被完全分离和收集。这一特性不仅解决了传统微格室培养中菌液难以分离的问题，还为后续的研究和应用提供了极大的便利。

研究成果与应用前景

为了验证该方法的有效性，研究团队以长双歧杆菌这一严格厌氧菌为例进行了深入研究。双歧杆菌作为一种常见的厌氧菌，特别是长双歧杆菌，其在发酵过程中会产生具有重要价值的产物。例如，长双歧杆菌发酵产物是二裂酵母溶胞提取物，这是一种在化妆品行业中备受瞩目的重要原料，且双歧杆菌本身则是一种高价值益生菌。通过实验对比发现，在 Pickering 乳液滴中培养双歧杆菌，其生长效率显著高于传统的 MRS 培养和 MRS 加油封培养方法。在不同的培养时间节点，如 12 小时、24 小时和 48 小时等，Pickering 乳液培养体系中的双歧杆菌浓度都呈现出明显的优势。

同时，该方法还能保持细菌的高活性。通过荧光标记技术对细菌进行活性检测发现，在培养过程中，Pickering 乳液培养体系中的双歧杆菌死亡率明显低于传统的 MRS 培养体系，这表明该方法能够为细菌提供更为适宜的生长环境，减少外界因素对细菌的损害。

图3.液滴格室化培养双歧杆菌与快速分离

图4. 双歧杆菌培养效果对比

这种智能乳液相反转的方法在厌氧发酵、合成生物学和生物制造等多个领域具有极其广阔的应用前景。在厌氧发酵领域，它有望提高厌氧微生物的发酵效率，生产出更多具有高附加值的产品。在合成生物学方面，该方法可以为基因工程菌的培养和研究提供更为有效的手段，有助于推动合成生物学的进一步发展。在生物制造领域，例如在生物催化和细胞工厂微反应器中的产品分离等过程中，这种智能乳液相转化的方法可能带来全新的思路和解决方案，提高生产效率和产品质量。

文章链接：
https://doi.org/10.31635/ccschem.024.202404698