安徽农大孙凯、南京农大高彦征ES&T：Fe（Ⅲ）辅助Novosphingobium sp. ES2-1调控17β-雌二醇降解机制

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成果简介

2024 年 12 月 5 日，安徽大学李舜尧博士、安徽农业大学孙凯教授、南京农业大学高彦征教授在 Environmental Science & Technology 上发表了题为 “Fe(Ⅲ)-Aided Novosphingobium sp. ES2-1 Regulates Molecular Mechanisms of 17 β -Estradiol Biodegradation” 的论文。

17 ꞵ - 雌二醇（ E2 ）是全球范围内对野生动物和人类健康威胁最大的环境雌激素（ EEs ）之一。微生物降解是 E2 污染修复的一种替代策略，其可能受到环境中普遍存在的 Fe （ III ）调控。先前，我们获得了一株 E2 降解菌 Novosphiongobium sp. ES2-1 ，并探讨了该菌代谢途径与单加氧酶 EstO1 诱导 B 环裂解的关联；然而，关于 E2 中环 A 裂解的分子机制的研究十分缺乏，特别是在 Fe （ III ）辅助调控下。本文报道了一种来自菌株 ES2-1 外二醇双加氧酶 EstN1 参与 E2 的 A 环裂解途径。在由铁氧还蛋白 EstN2 和铁氧还蛋白还原酶 EstN3 组成的电子传递链支持下，催化 4- 羟孕酮（ 4-OH-E1 ）发生 4,5- seco 反应，生成环 A 间位裂解产物。 Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 可以通过增强 estO1 和 estN1 基因表达，巩固 E2 中环 A/B 裂解，从而促进 E2 代谢。与缺乏 Fe （ III ）相比， Fe （ III ）辅助的 E2 生物降解半衰期由 1.35 d 缩短至 0.59 d 。同时， Fe （ III ）诱导后 estO1 和 estN1 基因的转录量分别由 4.3 倍增加至 47.5 倍和 6.6 倍增加至 246.8 倍，并显著提高了环 A/B 裂解产物及其吡啶衍生物的丰度。研究结果强调了 Fe （ III ）在分子水平上调控 EEs 生物修复中的重要意义。

EEs 是一类骨架稳定的新兴污染物，在极低浓度下即可引起生物体的内分泌干扰作用。食物链是 EEs 进入动物和人体的重要渠道，该类污染物会诱发人类疾病和野生动物性别比紊乱，威胁生态环境健康。微生物修复在降低 EEs 环境污染风险方面具有广阔的应用前景。目前，研究者已经提出了 4 种 17 ꞵ - 雌二醇（ E2 ， EEs 代表物）生物降解途径：（ Ι ） E2 在 C16-C17 处脱氢生成雌甾四烯（ E0 ）；（ ΙΙ ） E2 在 C4 处羟基化生成 4- 羟基 -E2 （ 4-OH-E2 ）；（ ΙΙΙ ） E2 在 D 环 C17 处脱氢生成雌酮（ E1 ）；（ ΙV ） E2 在 B 环羟基化。其中， ΙΙΙ 是 E2 生物降解最常见的途径。 Fe （ III ）作为辅助因子对铁依赖酶的活性至关重要，同时也是氧化还原的载体和电子呼吸链的重要组成部分。

Fe （ III ）广泛存在于生态环境中，能够促进细菌生长和酶分泌，并协助目标污染物的生物降解。然而，关于 Fe （ III ）辅助降解菌对 E2 氧化裂解过程的研究非常有限， Fe （ III ）调控的降解菌中编码环裂解酶的基因表达也不清楚。我们研究了 Fe （ III ）调控中菌株 ES2-1 对 E2 生物降解的差异，包括生物降解动力学、典型 E2 代谢产物丰度和 E2 降解基因表达；鉴定出 Fe （ III ）调控的 A- 环裂解基因，并在分子水平上验证了其功能；揭示了 Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 诱导 E2 生物降解的分子机制。这些结果不仅丰富了 EEs 降解基因库，而且在分子水平上阐明了 Fe （ III ）在调控 EEs 微生物修复中的重要性。

图文导读

Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 降解 E2 的特性

图 1 ： Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 对 E2 的生物降解

特定浓度的 Fe （ III ）有利于刺激 Nov. sp. ES2-1 对 E2 的生物降解，而高浓度 Fe （ III ）会抑制微生物生长（图 1 ）。与缺乏 Fe （ III ）相比，在 0.1 mg/L Fe （ III ）存在下， E2 生物降解率在 5 d 内从 73.9% 提高到 83.4% 。 Fe （ III ）浓度升高至 0.5 mg/L 时，菌株 ES2-1 对 E2 的生物降解和生物量持续增加。然而， Fe （ III ）浓度升高到 10 mg/L 时， E2 降解和细胞计数与 0.5 mg/L 条件下没有显著差异。因此， 0.5 mg/L Fe （ III ）是菌株 ES2-1 降解 E2 的最佳浓度。采用拟一阶模型拟合 Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 降解 E2 的动力学曲线。与缺乏 Fe （ III ）相比， 0.5 mg/L Fe （ III ）促使菌株 ES2-1 降解 E2 的动力学常数由 0.512 d ^-1 显著地增加至 1.181 d ^-1 。 UPLC-HRMS 识别出 Fe （ III ）存在条件下 E2 生物降解的 9 种代谢物，包括 E1 、 4-OH-E1 、 P3-P5 、 N1-N2 和 Ns1-Ns2 ，与缺乏 Fe （ III ）的结果一致。 Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 促进了环 A/B 裂解产物的产生，并加速了初始产物 E1 和 4-OH-E1 的快速消耗，而 4-OH-E1 下游的 B 环裂解产物 P3 和 A 环裂解产物 P4 富集明显 。

参与环 A/B 裂解的基因分析

图 2 ：参与环 A/B 裂解的基因分析

estN1 基因产物与 Sphingomonas sp. KC8 的 4,5- 外二醇双加氧酶 OecC 和 Nov . sp. ARI-1 的双加氧酶 EdcB 相同，相似性分别为 44.3% 和 56.1% 。 ORF 分析表明， OecC 和 EdcB 均属于 Ⅰ 型外二醇双加氧酶，该酶催化 4-OH-E1 的 4,5- seco 反应，导致 A 环间位裂解。然而， EstN1 与这些 Ⅰ 型外二醇双加氧酶以及具有儿茶酚结构的已知底物形成了一个单独的进化分支，说明 EstN1 表现出相对较新的分类地位。此外， EstN1 与 Comamonas testosteroni TA441 的双加氧酶 TesB 和 Mycobacterium tuberculosis H37Rv 的铁依赖性外二醇双加氧酶 HsaC 分别具有 30.5% 和 35.8% 的同源性，两者都催化了具有类似 4-OH-E1 的儿茶酚结构的底物间位裂解（图 2 ）。 EstN1 、 OecC 、 EdcB 、 TesB 和 HsaC 保守结构域的预测和比较表明，这 5 种蛋白都具有一个被归类为邻氧螯合物（ VOC ）超家族的特定结构域。 5 个 VOC 结构域重叠片段的多重序列比对显示， EstN1 中至少有 2 个铁结合位点，位于氨基酸 219 和 282 残基上。综上所述， estN1 基因在 E2 生物降解过程中编码以 Fe 为激活因子的 A 环裂解酶。 RT-qPCR 结果显示，预测的 A 环裂解双加氧酶编码基因 estN1 在 E2 诱导下的相对表达量上调了 4.3 倍，进一步支持了 estN1 基因与 A 环裂解相关的可能性。特别是，补充 Fe （ III ）后 estN1 的转录水平上调至 47.5 倍。此外， E2 诱导的 B 环裂解基因 estO1 相对表达被显著刺激， Fe （ III ）使其转录水平从 6.6 倍上调至 246.8 倍。可见， estN1 基因与已知甾体环 A 裂解基因的一致性，加上 E2 诱导的转录水平上调，表明 estN1 基因极有可能是参与 E2 环 A 断裂的候选基因。可见， Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 刺激了编码环裂解酶的 estN1 和 estO1 基因表达，从而加强了环 A/B 的裂解过程，增加了环 A/B 裂解产物的丰度 。

EstN1 的体外功能验证

图 3 ： EstN1 的体外功能验证

验证了预测的编码 estN1 基因环 A 裂解酶的体外功能。 EstN1 属于 Ⅰ 型外二醇双加氧酶，需要铁氧化还蛋白和铁氧化还蛋白还原酶作为氧化还原伙伴（ ETPs ），在体外为加氧酶组分输送还原力。然而，菌株 ES2-1 基因组的 ORF 分析发现，在 estN1 附近没有铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶编码基因。因此，我们预测了 7 个可能的铁氧还蛋白基因和 2 个可能与 estN1 匹配的铁氧还蛋白还原酶基因。 ETPs 编码基因以及 estN1 基因在 E. coli 中作为 N 端 His 标记的融合蛋白被单独克隆和过表达（图 3 ）。 SDS-PAGE 结果显示，这些蛋白的分子量与理论值一致。采用 EstN1 分别组装了 14 个由不同铁氧还蛋白和铁氧还蛋白还原酶组成的 ETPs 。当 EstN1 与由 IM701_RS17870 （ EstN2 ）和 IM701_RS20840 （ EstN3 ）组成的 ETPs 匹配时，三组分体系对 4-OH-E1 具有明显地催化活性。重要的是， E2 还可以诱导 estN2 和 estN3 基因的表达。此外， EstN1N2N3 体系更倾向于 NADH 作为电子给体。在 NADH 存在下， 25℃ 时 EstN1 对 4-OH-E1 的 K _m 和 V _max 分别为 80.5 μM 和 4.6 U/mg 。 UPLC-HRMS 鉴定结果指出， EstN1N2N3 催化 4-OH-E1 氧化生成产物的 m / z （ [m +H] ⁺ ）为 319.1478 ，比 4-OH-E1 （ C ₁₈ H ₂₂ O ₃ ）高一个氧分子，表明 EstN1N2N3 催化 4-OH-E1 双氧作用生成化学式为 C ₁₈ H ₂₂ O ₅ 的产物。与已知结构的 4-OH-E1 的 ¹ H-NMR 谱相比， C ₁₈ H ₂₂ O ₅ 没有出现 δ _H 4.97 （ s ）和 δ _H 5.15 （ s ）化学位移的谱带，证实没有儿茶酚结构。低场区（ δ 6.5-7.0 ）没有明显的吸收峰，说明产物中没有芳香环质子， A 环（苯酚环）发生了断裂。此外，低场区（ δ 8.0-8.6 ）出现了一条单带，其 δ _H 8.5 比芳香环质子（ δ 6.5-7.0 ）的化学位移向低场移动，表明它可能代表羧基氢。其次，在中间区域（ δ 4.5-5.0 ）出现一个积分值约为 1 的三重态 δ _H 4.61 （ t, J = 8.5 ），说明与 C-1 连接的 H-1 由于与 C-2 连接的两个氢质子自旋而分裂成三个峰。而 δ _H 2.80 （ d, J = 6.0 Hz ）处的共振信号与 C-2 连接的两个氢质子一致，其积分值是 δ _H 4.61 处三重态的两倍。再次，高场区（ δ 0.5-2.5 ）的能带总积分约为中场区（ δ 2.5-3.0 ） 9 倍，这意味着剩余的甲基和亚甲基质子总数约为 18 个，这与 B 环、 C 环和 D 环上的质子数量一致。综上所述，氧化产物在 A 环的 C4-C5 处发生了间位裂解，形成了含有羟基、羧基等活性氢的官能团 。

Fe （ III ）辅助 E2 生物降解的分子机制

图 4 ： Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 降解 E2 的分子机制

如图 4 所示， E2 脱氢生成 E1 ，并通过细胞色素 P450 酶 Estp1 介导的单氧氧化生成 4-OH-E1 。 4-OH-E1 的 B 环被黄素单加氧酶 Est01 和支配的 9,10- 间位反应裂解。虽然， A 环的裂解是由外二醇双加氧酶 EstN1 催化的 4,5- seco 反应完成，但其还原能力可以由 EstN2 和 EstN3 组成的 ETP 传递。 Fe （ III ）调控环 A/B 的裂解过程：在缺乏 Fe （ III ）条件下，环 A 裂解酶编码基因 estN1 表达不强，环 A 裂解不是显性过程；因此， E2 代谢主要沿着 B 环裂解途径进行。相反， Fe （ III ）通过刺激 estN1 基因表达唤醒了 A 环裂解的休眠过程。同时， estO1 基因的转录水平也得到了巩固。通过 estO1 基因，环 B 的打开比缺乏 Fe （ III ）时更活跃。因此， Fe （ III ）辅助菌株 ES2-1 诱导了 estO1 和 estN1 基因的强烈表达，促进了环 A/B 的破坏，加强了 E2 的生物降解。