连续排渣离心技术：解决高密度哺乳动物细胞培养物澄清难题的方案

生物制品圈 · 公众号 · 生物 · 2025-03-17 10:48

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澄清通常是从哺乳动物细胞培养物中纯化单克隆抗体（MAbs）和其他蛋白质的首个单元操作。这一过程会从培养液中去除细胞和细胞碎片，以产生适合进一步纯化的澄清细胞培养上清液。

2000年以前，深层过滤和切向流微过滤是生物制药行业的标准澄清技术。工业规模的离心分离被视为一项重大的资本投资，而且生物工艺工程师对控制（尽量减少）剪切力对哺乳动物细胞的影响的能力有限。在接下来的十年里，整个行业开始采用传统的定期排渣离心法对哺乳动物细胞培养物进行初级澄清。随着收获的细胞培养密度和滴度不断提高，需要扩大工艺规模以处理10000升至15000升的生物反应器，这推动了向离心技术的转变。离心技术在设计和操作条件方面取得的重大进步，将剪切力对哺乳动物细胞的影响降至最低。

离心技术在许多生物工艺应用中都有使用，包括激素、疫苗和酶生产过程中溶液的澄清；细菌培养物的收获；以及血液成分的浓缩和分离。用于这些应用的典型离心机有：在小体积工艺中使用的管式离心机、在进料固体浓度较高时（例如在污水处理中）使用的卧螺离心机，以及碟式离心机。

后者（碟式离心机）常用于生物制药行业的澄清操作。碟式离心机连续进料，但排渣方式分为定期排渣和连续排渣两种。进料流在离心机转鼓以高离心力旋转时被送入。由于密度差异，细胞被离心力甩向转鼓边缘，并在固体收集区积聚，而不含细胞的离心液则通过向心泵沿着叠片向上流动，被收集起来进行进一步处理。 施加离心液背压是为了确保离心机在液封状态下运行，并使转鼓始终保持充满状态。

在过去20年里，细胞培养密度和滴度显著提高，这提升了批次生产效率。但这种增长给离心过程带来了负担，因为固体排放间隔变得过短且难以控制。因此，澄清上清液中较高的浊度以及相关的产品损失会损害离心机工艺的稳定性。较高的细胞密度和滴度带来的挑战，需要一种更可靠的固体排放方法，同时还要将资本投资和设施占地面积降至最低。

连续排渣碟式离心技术已在其他行业，如酿造业中得到应用，用于稳定地从工艺流中去除固体杂质。连续排渣离心与定期排渣离心（见图1和图2）的不同之处在于，固体不是定期排出，而是通过碟片上方的通道向上移动，经喷嘴连续排入一个带有自身向心泵（比收集离心液的向心泵更大）的腔室中。该向心泵通过排放管道将高浓度的固体流泵出。浓缩流中的固体百分比与其流速相关，而流速由阀门控制。

在此，我们比较了Biogen使用间歇排渣离心和连续排渣离心对高滴度/高密度IgG1单克隆抗体的澄清性能。我们详细阐述了这项新技术（连续排渣离心）在蛋白质治疗药物行业中的应用，如何实现稳健的澄清工艺。我们在同一生产系统（离心橇）内，通过更换转鼓和进行小规模管道改造，从间歇排渣离心转变为连续排渣离心。

我们使用中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系为所有研究提供IgG1单克隆抗体培养材料。细胞培养过程包括解冻高密度工作细胞库的冻存管，然后进行接种物扩增步骤，并通过多个上游生物反应器阶段（60升、235升、950升、3750升和15000升）进行规模放大。 在启动收获单元操作之前，将生产生物反应器（15000升）冷却至2 - 8°C，这可以提高产品稳定性并降低微生物污染的风险。 接下来，使用25%的醋酸将培养物的pH值从7.0降至4.8，以诱导细胞和细胞碎片絮凝成更大的颗粒，并沉淀宿主细胞杂质（从而减少宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白，且对产品质量无不利影响）。这通过减轻下游纯化过程的杂质负担，促进了下游分离。

就在开始收获单元操作前，我们采集样本并进行混合，以确保细胞均匀分散。将样本移液至三个离心管中，然后使用贝克曼Allegra X - 14台式离心机进行离心，以测定低pH收获进料流的细胞压积（PCV，以固体百分比表示）。我们将样本以2750转/分钟的速度离心6分钟，然后将离心管放入游标卡尺中测量每个样本的固体含量。我们将PCV值输入离心机的分布式控制系统（DCS），该系统会自动对这些值取平均，并使用以下详细公式计算固体排放间隔（用于间歇排渣离心）或浓缩物流速（用于连续排渣离心）。

开发稳健的离心工艺时，除了考虑放大参数外，还需要考虑离心机进料流的特性。表1展示了所评估的五个批次（临床批次1 - 3、验证批次4和5）未经调整的收获存活率百分比，以及低pH收获（离心机进料）的细胞压积（PCV）百分比。

从开发/中试规模到生产规模，两个离心放大参数保持恒定：Q表示离心机进料流速，西格玛（Σ）表示为达到与碟式离心机同等分离效率所需的重力沉降面积。Σ取决于多个因素，包括离心机的几何形状、碟片堆叠中的碟片数量以及转速。根据安布勒的推导，西格玛理论定义了去除给定直径一半颗粒群所需的Q/Σ，如公式1所示，其中vg为颗粒因重力产生的沉降速度，Δρ为固体颗粒与液相之间的密度差；d为颗粒直径；g为重力加速度；μ为动态粘度。

因此，要实现对特定粒径颗粒的100%去除，流速必须降低一半。在公式2中，Σ代表离心机的等效澄清面积（平方米），g是重力加速度（米/秒²），ω是转鼓角速度（弧度/秒），N是碟片堆中的碟片数量，α是碟片半锥角（°），r0是碟片外半径（米），ri是碟片内半径（米）。

以下是在典型工艺转鼓转速下，不同规模离心机的Σ值：

CSC - 6（中试规模离心机），其Σ值为CFD - 130设备的3%

CSD - 130（配备定期排渣离心机的大规模生产设备），其等效澄清面积为CFD - 130设备的90% 。

CFD - 130（配备连续排渣离心机的大规模生产设备），其等效澄清面积属于专有信息。

随着Q/Σ值降低，离心机能够有效去除的颗粒尺寸也会减小，从而提升澄清性能。碟式离心机通常无法有效去除小于1微米的细胞碎片和微粒。这一限制使得在后续下游处理之前，必须进行后续的深层过滤，以除去离心液（产品）流中存在的小颗粒。

为了澄清1 - 3批次临床项目批次的低pH收获进料流，我们使用了GEA CSD - 130定期排渣式GEA碟式离心机（图1）。低pH收获流通过液封入口输送至该离心机，这样可减少剪切效应。为了定期排出固体，转鼓通过液压排放装置打开。排放间隔根据公式3确定，其中Vs= 固体总体积（升）；Vx= 安全系数固体体积（V的80%）；Q= 进料流速（升/分钟）；PCV= 低pH收获物中的固体百分比。使用定期排渣离心法处理这三个临床批次时，其近似Q/Σ值为7.0纳米/秒。

为了澄清4号和5号验证批次的低pH收获进料流，我们使用了一台GEA CFD - 130型连续排渣碟片式离心机（CFD - 130）。该离心机的转鼓设计独特，能让浓缩物（可移动的固体物质）在固体收集区聚集，并通过碟片组上方的通道向上移动，最终经喷嘴实现连续排渣（如图2所示）。低pH收获液通过液封进料口进入离心机，固体则按上述方式持续排出。不过，固体输送泵喷嘴处可能会出现细胞堆积压实的情况，此时仍需打开转鼓进行排渣，但这种排渣方式的使用频率远低于间歇排渣离心机。CFD - 130连续排渣转鼓是在CSD - 130离心机橇座基础上改造而来，因此可以沿用相同的转鼓电机和配套设施。将CFD - 130转鼓集成到现有的CSD - 130橇座上，不仅节约了成本，还能快速更换转鼓，并且几乎不额外占用空间。

为了使浓缩物流的固体成分达到85%，浓缩物流速根据公式4确定，其中Q为进料流速（升/分钟），PCV为低pH收获物中的固体百分比。浓缩物流速（CF）由一个自动流量控制阀控制。

在离心过程中，通过测量流出液的浊度来评估离心液流（含产品）的性质，并检测绕过离心机的不同程度的碎片情况。对于1 - 5号批次，我们使用了在线离心液浊度传感器来评估离心机的澄清性能。这也有助于我们根据浊度变化来判断转鼓的固体容纳空间何时已完全填满并压实。

使用连续排渣离心法的两个验证批次的Q/Σ约为6.2纳米/秒。间歇排渣法和连续排渣法之间的Q/Σ差异很小，因此我们认为这对分离性能影响不大。在正常操作下，两种方法的排渣都是部分排渣：离心机转鼓打开的时间仅够将转鼓内的固体排出。如果部分排渣无法完全清除收集到的固体，那么可以进行完全排渣（排出整个转鼓内的物质，约25升）以使系统恢复平衡。然而，从产量角度来看，这并不理想，因为在完全排渣过程中，离心液会不可避免地损失。

进料流固体浓度变化：传统排渣法和连续排渣法都缺乏自适应反馈机制，无法在处理过程中，使排渣间隔（传统法）或浓缩物/固体流速（连续法）与进料流固体浓度（PCV）的变化保持同步。为了在间歇排渣离心机中补偿进料流PCV的变化，我们在计算中引入了一个安全系数（公式2中的Vx），从而防止在处理过程中固体容纳空间过度填充。这个安全系数在每次排渣时都会不可避免地浪费产品，因为当PCV样本值与实际进料流PCV相等时，体积（Vs-Vx）就是产品量。尽管有这个安全系数，由于进料流固体浓度不断变化（PCV变化），我们预计连续排渣也会出现一些问题，这些问题在间歇排渣离心机上已被观察到。

当PCV样本值显著低于实际进料流的PCV值时，离心机排渣频率过低。这会导致下游过滤器负荷增加，进而造成过滤器堵塞。随后，更换过滤器会导致产品损失，并对产品保存时间产生不利影响。

当PCV样本值显著高于实际进料流的PCV值时，离心机排渣过于频繁。这导致更多产品（上清液）被排放掉，从而总体上降低了离心机产品步骤收率。

为了对所有五个批次的产品（采用两种离心排渣方法）进一步提纯，Biogen的平台工艺在离心步骤之后，使用了密理博西格玛（MilliporeSigma）的Millistak X0HC深层过滤器。在这些过滤器中，基于硅藻土的双层深层过滤介质由带正电荷的树脂粘合剂固定（标称截留粒径小于0.1微米）。该收获工艺中的后续单元操作包括0.22微米精滤、中和以及病毒灭活，为下游加工做准备。

我们采用这两种不同排渣策略，旨在考察以下方面：以离心步骤收率量化的工艺有效性；工艺澄清效率（由离心液浊度以及后续下游过滤器的压差确定）。

定期排渣：中试规模的收获工艺开发实验为大规模生产提供了初始操作条件（图3）。如前所述，排渣间隔取决于低pH收获液中PCV（固体浓度）的测量值。我们假定固体在生物反应器中均匀分布，因此排渣频率需足够高，以防止大量固体混入离心液中。

前三个大规模临床批次采用了基于时间的定期排渣策略，类似于中试规模所开发的工艺。然而，在大规模临床批次中，我们观察到离心过程中离心液浊度升高。这种情况需要手动缩短排渣间隔时间，从而提高排渣频率（表2）。尽管采取了这一干预措施，但仍观察到离心液浊度升高。为了建立更稳健的离心过程控制，我们进行了完全排渣。这在降低离心液浊度方面更为有效，完全排渣能将离心机转鼓中收集的固体物质全部清除。然而，其后果是含有液体产品的部分损失增加。

尽管在大规模生产批次1和批次2的处理过程中，离心液浊度基线持续变化（图4），但所有变量保持恒定：转鼓转速、温度、进料流速以及离心液背压。这表明，离心液浊度的变化归因于某些改变产品进料流中固体浓度的工艺或设备因素。

在将生物反应器体积（图5）与批次2中的离心液浊度基线（图6）进行对比时，我们发现进料流中的固体浓度（PCV）似乎并不稳定。离心液浊度基线似乎与生物反应器中剩余的培养物体积相关。为了弄清楚这一现象，我们将收获液浊度曲线划分为三个不同区域（图6）。

基于图5和图6中的观察结果，我们推测，由于固体沉淀到生物反应器搅拌器叶轮下方（A区）导致混合不充分，以及搅拌停止时固体发生沉淀（B区），致使进入离心机的进料流中固体含量不均匀。这进而使得基于时间设定的排渣间隔，因无法确保进料流的均匀性，难以达到所需的排渣频率。由于固体含量不均匀，首个临床批次在完成全部澄清处理前不得不暂停。离心机下游的过滤器因固体负载过高而堵塞（图9）。

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