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未加帽mRNA平台的开发与应用

生物制品圈 · 公众号 · 生物 · 2025-02-08 10:42

正文

摘要： 本文报道了一种新型未加帽mRNA平台（BH-RACE平台），通过利用内部核糖体进入位点（IRES）替代传统5’帽结构，并采用未经修饰的尿苷三磷酸（UTP）合成mRNA，显著降低了生产成本并简化了工艺流程。该平台结合自主研发的脂质纳米颗粒（LNP）递送系统，在体外和动物模型中展示了高效的蛋白表达能力，并成功诱导针对新冠病毒Delta/Omicron变体和HSV2病毒的中和抗体及特异性T细胞免疫反应。研究结果为传染病疫苗、肿瘤治疗及蛋白质替代药物的开发提供了重要技术支撑。

mRNA技术的发展与挑战

信使RNA（mRNA）作为连接基因与蛋白质合成的关键分子，近年来在疫苗和药物开发领域取得了突破性进展。传统mRNA技术依赖5’帽结构和核苷酸修饰（如N1-甲基假尿苷，N1mψTP）以增强稳定性和降低免疫原性。然而，这些化学修饰和复杂工艺显著增加了生产成本，限制了技术的广泛应用。例如，Moderna和BioNTech的COVID-19疫苗虽成功应用，但其依赖的N1mψTP每毫克成本高达数百美元，且合成工艺需多步纯化步骤。

此外，mRNA的5’帽结构（如m7GpppG）虽能保护RNA免遭核酸外切酶降解并启动翻译，但其合成依赖复杂的酶催化反应，进一步提高了技术门槛。针对这一问题，植物病毒中发现的帽非依赖性翻译元件（如IRES）为替代5’帽提供了新思路。IRES通过招募核糖体和翻译起始因子，能够独立于帽结构启动蛋白质合成，从而简化mRNA设计。

BH-RACE平台的创新性

本研究的核心创新在于开发了一种名为BH-RACE（Rapid, Amplified, Capless and Economical）的未加帽mRNA平台。该平台具有以下特点：

省略5’帽结构 ：利用脑心肌炎病毒（EMCV）来源的IRES序列驱动翻译，避免依赖帽结构。
保留天然UTP ：未使用N1mψTP等修饰核苷酸，降低原料成本50%以上。
自主LNP递送系统 ：结合微流控混合技术，优化脂质配方（如Lipid-VI），实现高效封装（>90%）和均一粒径（70-100 nm）。

方法

1. mRNA构建与制备

质粒设计与IVT模板扩增

以实验室自建的pT7AMP质粒为骨架，插入IRES序列（EMCV来源）、目的基因（如新冠病毒Delta株S蛋白三聚体、HSV2截短糖蛋白D、荧光素酶等）及polyA尾（图1A）。通过PCR扩增获得高纯度IVT模板（130–380 ng/μL），经电泳验证为单一明亮条带（图1B）。

图1. IVT模板扩增与未加帽mRNA制备
(A) 未加帽mRNA结构示意图；(B) PCR扩增产物的电泳分析，显示高浓度模板；(C) IVT合成mRNA的琼脂糖凝胶电泳；(D) SEC-HPLC分析纯化前后mRNA纯度。

体外转录（IVT）与纯化

采用实验设计（DOE）优化IVT反应体系，包含T7 RNA聚合酶、无机焦磷酸酶及RNase抑制剂。未修饰UTP的mRNA产量稳定（3.8–4.8 mg/mL），经Oligo dT层析柱纯化后，SEC-HPLC显示单峰占比>99%（图1D）。

2. LNP封装与表征

脂质合成与配方优化

自主研发的离子化脂质Lipid-VI通过多步有机合成获得，结构经核磁共振（NMR）确认（图2A）。LNP配方由Lipid-VI、DSPC、胆固醇和DMG-PEG2000按50:10:38:2的摩尔比组成，通过微流控混合技术实现mRNA的高效封装（图2B）。

图2. mRNA-LNP的封装与表征
(A) Lipid-VI的化学结构；(B) 微流控混合工艺流程；(C) 封装mRNA的电泳分析，显示无游离RNA；(D) LNP粒径分布（Z平均=93.49 nm，PDI=0.116）。

关键参数检测

封装效率通过Triton X-100裂解法测定，六种mRNA-LNP的封装率均>90%（表1）。动态光散射（DLS）显示粒径分布均匀（PDI<0.2），符合药物递送标准。

表1.六种mRNA-LNP的关键指标测试数据

结果

1. 体外与体内蛋白表达

体外转染效率

eGFP-mRNA-LNP转染BHK细胞24小时后，荧光显微镜及流式细胞术显示转染效率>95%，且细胞形态正常，表明LNP无显著细胞毒性（图3A-B）。

图3. eGFP-mRNA-LNP的体外转染
(A) 转染细胞的明场与荧光图像；(B) 流式细胞术定量GFP阳性细胞比例。

体内表达动力学

肌肉注射Fluc-mRNA-LNP后，活体成像显示未加帽mRNA的荧光强度与加帽mRNA相当，且信号可持续至168小时（图4A-B）。低剂量（10 μg）未加帽mRNA仍能检测到显著荧光，表明其高效性（图4C-D）。

图4. Fluc-mRNA-LNP的体内表达
(A) 不同时间点的活体荧光成像；(B) 荧光信号定量分析；(C) 不同剂量下的荧光强度比较。

2. 免疫原性评价

新冠病毒S蛋白疫苗

叙利亚仓鼠接种SooT-mRNA-LNP（Delta株S三聚体）后，ELISA检测显示IgG抗体滴度达 10 ⁷ ，显著高于N1mψTP修饰组（图5D）。活病毒中和实验证实，该疫苗可同时中和Delta和Omicron变异株，中和滴度分别为1:512和1:256（图S2）。

图5. S蛋白mRNA疫苗的免疫效果
(A) 小鼠免疫实验设计；(D) 仓鼠血清IgG滴度比较（UTP组 vs. N1mψTP组）。

HSV2 gD蛋白疫苗

C57BL/6小鼠接种gD截短蛋白mRNA-LNP后，血清可完全中和6250 CClD ₅₀ 的HSV2病毒（图6B）。家兔皮内注射20 μg疫苗后，中和滴度达1:512，显著优于肌肉注射组（图6D）。

图6. HSV2 gD疫苗的中和抗体检测
(B) 小鼠血清中和病毒后的细胞病变抑制；(D) 家兔不同接种途径的中和滴度比较。

3. 细胞免疫应答

ELISpot检测显示，免疫小鼠脾细胞中IFN-γ斑点数显著增加，表明gD和S蛋白mRNA-LNP可激活抗原特异性T细胞（图7C, 7F）。

图7. T细胞免疫应答分析
(C) gD疫苗组IFN-γ斑点数；(F) S蛋白疫苗组IFN-γ斑点数。

讨论

技术优势与机制解析

IRES驱动的翻译优势 ：IRES通过招募真核起始因子（eIF4G）和核糖体蛋白，绕过了帽依赖性翻译的限速步骤。本研究中，未加帽mRNA的蛋白表达水平与加帽mRNA相当，可能得益于IRES的高效启动（图3B）。
UTP的免疫调节作用 ：未修饰UTP可能通过激活TLR7/8通路，增强抗原呈递细胞的活化，从而提升抗体滴度。与此相反，N1mψTP虽降低免疫原性，但也削弱了抗原特异性应答（图5B）。
自主LNP系统的兼容性 ：Lipid-VI与商业化脂质SM102性能相当，且其可电离氨基结构有助于mRNA的胞内逃逸（图4C-D）。

应用前景

传染病疫苗 ：针对快速变异的病毒（如流感、HIV），BH-RACE平台可缩短疫苗研发周期至6-8周。
肿瘤免疫治疗 ：个性化肿瘤新抗原疫苗（如 KRAS 突变体）已进入临床前研究，初步数据显示可激活 CD8+T 细胞。
蛋白质替代疗法 ：用于罕见病（如囊性纤维化）的mRNA药物正在开发中，其半衰期延长至72小时。

局限性与未来方向

核苷酸修饰的全面评估 ：需系统比较m5C、m6A等修饰对IRES活性的影响。
递送系统优化 ：开发靶向特定器官（如肺或肝脏）的LNP配方，以提升治疗效果。
临床转化挑战 ：需在大动物模型（如非人灵长类）中验证安全性与长效性。