以前发过两篇文章（见吉凯基因公众号），分别介绍了增加引物长度、提高退火温度与添加甜菜碱等方法来增加特异扩增的比例。都是在PCR反应管儿里面做文章，今天，我再将我毕生所学（肚子里也就这点儿墨水儿）的后三分之一拿出来分享给大家。
今天分享的是终极大招儿——器材党的福音！通过调整PCR程序，来实现特异扩增比例增加，非特异扩增比例降低甚至不可检测。
变性温度降温至退火温度时，大家一般都能听见PCR仪呼呼呼的风扇降温的声音。我想大部分小伙伴使用的都是默认降温速度，温度迅速下降。
诚然，一般PCR反应，使用默认降温速度是可以满足需求的。然而，对于序列复杂，相似程度高，GC含量高，乃至三核苷酸串联重复多，此种类型的模板，本胖儿的建议是，将变性到退火这一段的降温速度，调整到5秒一度，乃至更慢。
为啥这么做啊，听我给你唠！
引物与模板的结合，是错配以恒定概率发生的事件，并且，结合与解离过程是同时发生的。温度降低的快，引物与模板结合的就快，解离的慢，因此发生的错配就容易被固定下来。温度降低的慢，引物与模板结合的慢，解离也在慢慢发生，引物与模板就能够“逐渐磨合”到一个空间位阻最低的相互结合的位置，就是最佳的匹配结合位置。
打个比方：拉拉链比作延伸过程的话，慢慢拉一定比快快拉出错卡齿几率小，对不对！
当然，此法有一弊端，时间过久，例如，从98℃退火至65℃，降温速度为0.1℃/s，那么30个循环内，光是降温的时间就是30×（98-65）×10=9900秒=165分钟=2小时45分钟。
本胖儿热（年）情（幼）高（无）涨（知）的时候，就这么干瞪眼在实验室等过夜。。。
TouchDown又称为降落PCR。
原理是温度高时发生的特异性扩增多，温度低是发生的非特异扩增逐步增加。因此退火温度从高温到低温，随循环数逐步降低，最初循环中发生的主要是特异性扩增。后面随温度降低，即使非特异扩增与特异扩增以相同概率发生，但是由于起始循环中特异性扩增产物较多，后续扩增中，特异性扩增产物的积累速度也是远大于非特异扩增的。
例如一个PCR程序为30个循环，最初第一个循环中退火温度为65℃，每个循环降低0.5℃，那么程序后面循环的退火温度为64.5℃、64℃、63.5℃、…………52℃、51.5℃、51℃、50.5℃。
理想的扩增曲线如下图所示：
小技巧：退火温度设定范围建议是从（TM+5）℃ 逐步降温至（TM-5）℃。
不同厂家的PCR仪修改设置的界面不同，但都是可以进行修改的！
想实践的小伙伴，请开动脑筋，运用灵活的双手，自己去尝试一下！
这总共三篇文章的内容，至今为止，我只传授给我的亲师妹王小博和亲师弟朱小博。
泥萌还怀疑我博士狗的身份吗？下面给泥萌看真身！
3……
2……
1……
不走寻常路，不P寻常R。
三篇文章中分享的方法，相辅相成，三法合并，基本战无不胜，攻无不克！
然而，
吉凯cDNA现货库的出现，基本让各位科研临床小伙伴告别了自己动手装载体的阶段。
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又一个然而，
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