代谢组学研究究竟能挖掘出怎样的生物学机制？中国科学技术大学医学院发表在影响因子高达 17.6 分的 Science 子刊 Sci Immunol 上的这篇文章，给出了饶有趣味的答案（
其实代谢组学，作为一种组学，也就是同归纳法来进行数据的分析，通过米勒五法的求同求异法，找出不同分组内的差别，以此来提出假设，不清楚归纳法和米勒五法，以及科研推理的假设的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列
）。这是夏老师在 PubMed上冲浪时偶然发现的文章，该研究聚焦于微环境中 Treg 细胞受鞘氨醇合成的影响，以及由此引发的抗肿瘤免疫抑制现象。
研究伊始，科研团队着手分析肿瘤微环境（TME）中的代谢组学变化，旨在精准识别 TME 中含量增加的物质。（
下面这个热图大家应该都能看懂了，也就是通过组学分析的结果，在图中显示各个分组中不同物质的量的多少，这个在《夏老师带你读文献》里也都介绍过，可以去看看
）结果显示，TME 中大量与鞘脂合成相关的底物显著富集。
既然 TME 里鞘脂合成的底物明显增多，那么在这样的微环境下，会对 TME 中具有免疫抑制作用的 Treg 细胞产生何种影响呢？（
这一研究思路极富创意，恰似原材料供应增加必然会对其消费市场造成影响，其实这样的假设，也是基于已有结果而提出的，提出假设，则是一篇文章，或者一个课题得以推进的关键
）
研究人员首先将目光投向 Treg 细胞中的 SPTLC2—— 一种鞘脂合酶。他们发现，相较于脾脏中的 Treg 细胞，肿瘤微环境中的 Treg 细胞 SPTLC2 表达水平更高。
随后，研究人员进一步探究 SPTLC2 的表达是否受细胞因子刺激。为此，他们运用多种细胞因子开展分析，结果发现抗CD3抗体（可诱导激活 Treg细胞）能够有效激活 SPTLC2 的表达。抗CD3抗体通过激活 SPTLC2 的表达，进而激活了肿瘤微环境中 Treg 细胞内的鞘脂合成过程。
鉴于 TME 中的 Treg 细胞与 SPTLC2 的表达呈现高度同步性，研究团队大胆提出假设：SPTLC2 或许是 Treg 细胞发挥关键作用的基因。为验证这一假设，他们借助 Cre - LoxP 系统特异性敲除 Treg 细胞中的 SPTLC2（
此处采用 Cre 与 FOXP3 启动子结合的方式，也就是利用重组酶Cre和LoxP位点，对基因进行敲除或者敲入，在这里他们利用Cre-LoxP系统，实现了 Treg 细胞中 SPTLC2 的特异性敲除。若你对 Cre - LoxP 系统不甚了解，可阅读《列文虎克读文献》进行深入学习
）：
实验结果表明，特异性敲除 Treg 细胞中的 SPTLC2（
此过程实则遵循柯霍氏法则，通过移除某个关键因子，来展示其对于功能的影响，在这里他们敲除SPTLC2 来分析其在 Treg 细胞中的功能和影响。若你对柯霍氏法则不熟悉，可以看下《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》
），能够有效抑制 Treg 细胞的分化，同时显著增加 TME 中抗肿瘤相关的 CD8⁺ T 细胞数量，增强 TME 中的抗肿瘤反应。
回顾最初对 TME 中鞘脂合成底物丝氨酸含量的分析，为明确 SPTLC2 对 Treg 细胞的功能影响是否依赖于丝氨酸，而非
其他功能，研究人员深入分析了丝氨酸对 Treg 细胞的影响，
以及敲除 SPTLC2 后丝氨酸的作用变化。
结果显示，丝氨酸能够促进 TME 中 Treg 细胞的积累，且这种促进作用依赖于 SPTLC2。
既然 SPTLC2 可能通过促进鞘脂合成影响 Treg 细胞，那么其产物是否为影响 Treg 细胞分化的关键因素呢？这一假设别出心裁。通过对 SPTLC2 下游产物的细致分析，研究人员发现 SA（鞘氨醇）对 Treg 细胞的分化具有显著影响，可促进 FOXP3 的表达，同时抑制 T 细胞中炎性相关因子的表达。
那么，SA 究竟是如何影响这些基因表达的呢？（
在这里其实就是为了之后的假设迭出代的提出，预设了自己的想法，如果SA能影响基因的表达，那么对于下游基因的表达变化，肯定会做出贡献，但要分析这个过程，就需要查看SA对于下游基因造成的表达差异具体是什么，假设的迭代在这里充当了一个课题推进关键的推动剂，不清楚假设或者假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列
）：
为解答这一疑问，研究人员进行了 SA 处理后的单细胞测序。结果发现，SA 可诱导部分基因表达，而这些基因的激活均受 PD1 影响。进一步溯源，PD1 的启动子上结合着 c - Fos（
c - Fos 是较为常见的转录因子，位于 MAPK 信号通路中 ERK 的下游，而MAPK信号通路在免疫细胞的研究中，或是与炎症相关的反应中，都比较常见，若你对此信号通路不熟悉，可查阅《信号通路是什么鬼？》系列中的 MAPK 信号通路相关内容
）。基于此，研究团队提出大胆假设：鞘氨醇通过 c - Fos 影响 PD1 的转录，进而促进 FOXP3 的表达，实验结果也初步证实了这一可能性。
鞘氨醇又是如何影响 c - Fos 的呢？研究人员推测两者能够结合，且这种结合会影响 c - Fos 的转录活性。他们在分析二者的物理结合后，对 c - Fos 上与鞘氨醇的结合位点进行突变，并以突变体和野生型开展下游分析，旨在探究鞘氨醇与 c - Fos 无法结合时，是否会影响 c - Fos→PD1→FOXP3 通路中 FOXP3 的表达。
这是文章中验证最为严谨的环节之一，研究人员并未简单粗暴地敲除 c - Fos，而是将验证重点聚焦于 c - Fos 与鞘氨醇的结合，有效避免了 “肯定后件” 的逻辑谬误（若你对 “肯定后件” 概念不了解，可阅读《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《信号通路是什么鬼？》系列）
。结果表明，鞘氨醇→c - Fos→PD1→FOXP3→Treg 细胞分化这一过程依赖于鞘氨醇与 c - Fos 的结合。
那么，鞘氨醇与 c - Fos 的结合是否会影响 c - Fos 与其他靶基因启动子的结合呢？研究人员进一步分析鞘氨醇对 c - Fos 下游靶基因启动子结合的影响，结果显示，鞘氨醇能够促进 c - Fos 募集到靶基因的染色质可及区域，进而促进 c - Fos 下游的转录过程。
总体而言，这篇文章的研究思路颇具启发性。研究人员从微环境中的代谢组学差异入手，逐步深入剖析 Treg 细胞中响应代谢变化的基因，进而揭示代谢产物对 Treg 细胞分化的影响：
在机制假设方面，研究团队表现得较为大胆，鉴于鞘氨醇对 FOXP3 表达的影响，直接假设鞘氨醇与 FOXP3 上游的 PD1 上游转录启动相关的 c - Fos 存在关联，而未先考虑 FOXP3 相关转录因子与鞘氨醇的联系，或分析 PD1 蛋白与鞘氨醇的结合，逻辑上略显跳跃。然而，研究结果令人满意，真正做到了 “大胆假设，小心求证”。尤其是在验证鞘氨醇和 c - Fos 结合对下游表达变化的影响时，实验设计严谨周密。综合来看，这无疑是一篇值得深入研读的优秀论文。
今天的分享就到这里，若你对该研究感兴趣，不妨查阅原文深入探究。
祝愿大家在科研探索中目光敏锐，有所收获！
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