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高精度测量，Science！

研之成理 · 公众号 · 科研 · 2024-10-13 08:27

正文

▲第一作者：Steffen J. Sahl

通讯作者：Steffen J. Sahl，Stefan W. Hell

通讯单位：德国马克斯·普朗克多学科科学研究所，德国哥廷根大学

DOI：10.1126/science.adj7368（点击文末「阅读原文」，直达链接）

Science编辑Michael A. Funk评语：

在纳米尺度上直接测量距离对于光学技术来说是一个挑战，即使对于那些使用亚衍射分辨率荧光显微术的方法也是如此。Sahl等人完善了一种称为MINFLUX的光学方法，使他们能够精确测量1到10纳米范围内以及小于1纳米的倾斜分子内的分子间距离。通过使用多脯氨酸标尺，作者们展示了对已知个位数纳米间距的荧光团的分辨能力。他们将这种方法应用于标记了光活化染料的蛋白质之间和内部的宏观分子测量，包括当前间接方法无法测量的过短距离。成像实验证明了这项技术研究细胞内蛋白质-蛋白质相互作用的潜力。

研究背景

几十年来，对蛋白质、其亚基或其他生物分子之间的纳米级距离进行光学研究一直是Förster共振能量转移（FRET）显微术的专属领域。

研究问题

本文展示了MINFLUX荧光纳米显微术能够直接、线性地并以埃级精度测量小至1纳米的分子内距离——以及在平面投影中小至1埃的距离。本文的方法通过对多肽和蛋白质中已明确表征的1到10纳米距离进行量化得到了验证。此外，本文还可视化了免疫球蛋白亚基的取向，将该方法应用于人类细胞，并揭示了组氨酸激酶PAS结构域二聚体的具体构型。我们的研究结果为通过直接位置测量在宏观分子尺度上检查邻近关系和相互作用打开了大门。

图1| 基于直接光学测量位置的埃级精确分子内距离测量，适用于FRET范围及更远

要点：

1.本文展示了MINFLUX定位技术能够在室温下以亚纳米级的精度线性地确定（分子内）距离。在MINFLUX定位中，通过将已知的环形激发光束中心零点的位置与未知的荧光团位置相关联并理想匹配来确定荧光团的位置（见图1A）。因此，MINFLUX意味着最小化而不是最大化所需荧光光子的数量。因为在MINFLUX定位中，定位精度σ与检测到的光子数量呈指数关系e−N，所以克服了基于相机的定位问题。实际上，达到相机定位精度所需的检测光子数通常比MINFLUX少约100倍。通过使用光激活型（笼状）荧光团，还可以确保发射的正交性，使得一个荧光团发射而另一个荧光团对激发光完全惰性。此外，使用圆偏振环形零点的荧光团定位使得定位在很大程度上独立于它们的取向。这种可靠的荧光团坐标确定能够直接测量静态分子距离，即，无需通过如FRET这样的多因素过程来介导。因此，量化1到20纳米的距离使我们能够可视化例如一个小的16 kDa蛋白质的端到端距离，或通过直接定位测量报告荧光团来获取较大的150 kDa蛋白质的构象细节。

2.将可光激活染料DiMeO-ONB-SiR637与多脯氨酸链P-n的两端连接，其中n是脯氨酸残基（P）的数量，且N端和C端带有甘氨酸或赖氨酸残基，从而产生了假设的线性单分子系统（见图1B）。合成过程受到控制，以确保肽在脯氨酸重复数上没有变化，这意味着荧光团之间的间距d可以从小于3纳米（对于P-5）调整到大于10纳米（对于P-40），预期是基于所有全反式肽键的高度伸展型II（PPII）螺旋长度（见图1C）。这些肽以高稀释度非特异性地固定在涂有聚左旋赖氨酸的盖玻片表面，并单独进行检查。

图2|多脯氨酸端到端距离的分子内MINFLUX成像

要点：

1.在多达20个脯氨酸残基的范围内，平均测量距离与脯氨酸残基数呈现近似线性关系。线性回归分析显示，每增加一个脯氨酸残基，距离增加约0.21纳米。尽管分子动力学模拟可以解释由于链弯曲导致的端到端距离减少，但观察到的每个残基平均增加2.1埃与全PPII构象不符。全反式键合的PPII构象预期每残基增加3.1埃，但本文的数据低于此值，可能表明存在顺式和反式肽键结构的混合。

2.恒定的偏移量（y轴截距）为1.9 ± 0.2纳米，部分原因可能归因于末端甘氨酸和赖氨酸残基作为连接体对荧光团的位移，以及荧光团的物理尺寸，这为两端的“发射中心”增加了额外的距离。通常，距离变化的其他贡献可能来自运动或与基底的非水平附着以及二维投影测量。总体而言，示例数据的水平排列显示，通过MINFLUX可以解析和量化整个分子内距离的“阶梯”（见图1C和图2B）。

图3| 蛋白质内大分子距离测量：蛋白质上的位点和蛋白质亚基的定位

要点：

1.接下来，本文研究了用于端到端距离测量的C端和N端标记的骆驼科纳米抗体。这种紧凑的16 kDa蛋白质的核心将其C端和N端定位在约3.7纳米的距离上（见图3A）。末端通过马来酰亚胺与末端半胱氨酸偶联，用较不疏水的可光激活染料，Abberior CAGE 635进行标记。MINFLUX轻松解析了这一间距，测量的（投影）距离主要集中在2.5到5纳米范围内（见图3B）。距离分布（见图3C）在约3.8纳米处达到峰值。

2.有趣的是，距离分布伴随着较长间距的尾部，偶尔延伸到约16纳米。特别是，7到9纳米和10到13纳米范围内的距离（见图3E中的示例）表明存在纳米抗体二聚体和三聚体，其端到端距离预计会落在这个范围内。我们假设在马来酰亚胺标记协议中通过游离半胱氨酸的二硫键桥接形成了二聚体或三聚体（见图3D和E）。梯度凝胶SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析确实揭示了在考马斯亮蓝染色和紫外光激活后观察到的荧光中都存在二聚体和三聚体（见图3F）。

3.由于MINFLUX具有高空间分辨率，尽管原始样品中低丰度，它显然通过距离测定直接识别了二聚体和三聚体。通过尺寸排阻色谱法富集寡聚体的混合物测量使我们能够将子群分配到四聚体大小，大约为单体端到端距离的倍数（见图3H）。虽然相应的凝胶荧光（见图3G）表明单体较少，但MINFLUX识别出单体是最丰富的物质，可能是由于不同纳米抗体物种之间表面吸附的不同动力学的结果。请注意，二聚体、三聚体和四聚体的间距超出了FRET的范围，突出了MINFLUX也能测量>10纳米的距离的能力。

图4| 细胞中标记蛋白距离的量化

要点：

1.接下来，本文在人类骨肉瘤（U-2 OS）细胞中稳定表达了HaloTag与Lamin A/C的N末端的翻译融合蛋白。核纤层蛋白是形成中间丝的纤维蛋白，为细胞核提供结构稳定性并影响基因表达。由纤层蛋白形成的直径约为3.5纳米的丝状物比微管（24纳米）、波形蛋白（10纳米）或肌动蛋白（8纳米）丝状物要细得多。现有的纤层蛋白结构模型表明，这种组装基于由于卷曲螺旋域相互作用而形成的反向平行二聚体对。这种排列解释了均匀厚度的丝状物，其中球状Ig样结构域在各个纤层蛋白的C末端成对排列，平均每隔约20纳米（见图4A）。在这种排列中，N末端的成对间距沿丝状物有两个不相等的距离，总和约为40纳米。

2.在本文的基底核膜成像实验中，一种染料偶联的配体结合了HaloTag。二维MINFLUX图像区域的例子（见图4B）包含了标记位点的几何排列，这些位点似乎沿着一条线排列，同时也能看到小间距的成对位点。顺便说一下，所展示的区域仅跨越一个衍射区（直径约300纳米）。对于识别出的标签位置，其最近邻距离的直方图包含有周期性的证据，这可以通过单个~15纳米、~25纳米和~40纳米间距的组合来解释。许多成对的位点似乎对应于直接相邻的N末端（HaloTags）对。由于许多最近邻距离也低于10纳米，并且能够以高精度可靠地测量（见图4 C和D；N = 266），这些实验证明了在细胞中可以直接量化小于10纳米的距离。

图5| 在FRET范围内及以下的距离构象测量，以及埃级距离测量：平行和反平行配置的蛋白结构域二聚体

要点：

1.为了展示这一能力，本文研究了一种蛋白质结构域二聚体——细菌柠檬酸传感器组氨酸激酶（CitA）的胞质PAS结构域（PASc）。这样一个同源二聚体系统用FRET研究尤其困难，因为该方法通常依赖于两种不同的染料。PASc的晶体学数据显示，这种二聚体可以采取反平行和平行排列（见图5A）。现在认为，在柠檬酸结合时，一种显著的四级结构重排在反平行到平行转变中起着中心作用，作为跨膜信号传导过程中的一部分，传递并放大最初微小的结构变化。

总结与展望

MINFLUX荧光团定位精度达到约0.1纳米，使得距离测量准确度可以达到荧光团物理尺寸的约1纳米（见图5）。对于位于角度倾斜且因此在待测距离上彼此不遮挡的大分子上的荧光团，本文量化了远低于1纳米的距离。通过对小蛋白质和寡聚体的端到端距离进行解析，这些测量提供了进入宏观分子尺度的光学途径。正如在平行和反平行二聚体配置中区分1至4纳米距离所展示的那样，MINFLUX还直接解析蛋白质亚基及其相对取向和构象。本文的研究进一步表明，通过仅观察空间间隔两端的两个荧光团，可以直接获得分子内分辨率。与基于相机的定位不同，不需要长时间顺序结合数百个新鲜荧光团至两个位点。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.adj7368

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