浅谈冷冻干燥

摘要：冷冻干燥，也称为冷冻干燥，是一种常用的干燥技术，用于提高在液态下稳定性较差的产品的储存稳定性。本章首先讨论了冷冻干燥的优点和缺点，以及其使用可能有益的情况。详细描述了冷冻干燥所涉及的设备，冷冻干燥过程的各个阶段，冷冻干燥配方的设计和组成，以及监控和控制过程的各种技术。最后，还简要描述了冷冻干燥固体状态下的动力学和预测产品稳定性和保质期的模型。

1.为什么选择冷冻干燥？

对于新治疗实体的发现和开发至关重要的是，它必须以适当的剂量形式填充和完成，具有足够的保质期并满足患者依从性，否则多年的努力将不会给制药/生物制药行业带来任何好处。在水溶液中稳定性较差的治疗分子通常会干燥以提高稳定性并延长保质期，因为已知大多数（小）分子的稳定性通常按溶液

1. 它是一种低温过程，因此与“高温”过程（如喷雾干燥）相比，预期会导致较少的热降解；

2. 它不涉及最终灭菌步骤，并且比其他过程更容易保持产品的无菌和“无颗粒”特性；

3. 它为控制残留水分含量和瓶内空间气体组成提供了一种方法，对于那些储存稳定性受残留水分含量和瓶内空间气体组成影响的产品，如氧气；

4. 它的放大容易，并且提供了合理的工艺产率。

2.设备 

集成冷冻干燥机和自动化系统的主要功能是在保持其无菌完整性的同时，促进无菌填充药物产品的冷冻干燥（冷冻干燥）。为了保持无菌完整性，该单元必须能够执行原位清洁和原位灭菌循环，以满足既定的验收标准。在完成冷冻干燥过程后，该单元必须能够通过除霜循环去除冷凝器表面上的冰层。该单元还将能够作为工厂测试循环的一部分执行配方定义的主要子系统测试，以验证系统完整性、评估性能或进行维护故障排除。集成冷冻干燥机和自动化系统将具有自动装载、卸载和处理功能。特定过程及其相关参数和报警限值将由用户选择配方。此外，在过程开始时，将自动启动周期运行报告以收集该批次的关键数据和事件。周期运行报告将成为该过程批次记录的组成部分。自动化系统将连续跟踪用户定义的一组数据，这些数据可用于实时或未来访问。冷冻干燥机由两个主要部件组成：干燥室和冷凝器，以及制冷系统、真空系统和控制系统。 

2.1.干燥室 

干燥室由几个由AISI 316L不锈钢制成的架子组成，上面放置着部分密封的瓶子或容器，其中含有溶液，这些架子通过热传递流体的流动进行温度控制，范围从60°C到-50°C。架子通过足够直径的液压缸移动以产生塞压力。架子的移动有助于瓶子的装载/卸载和清洁过程。常见的制冷系统通过架子热传递流体系统内的热交换器为架子提供冷却。根据用途，架子和瓶子的数量不同，研究等级通常有三个架子，可容纳几百个瓶子，而典型的生产规模冷冻干燥机可能有10-20个架子（图1），根据大小可容纳50,000到100,000个瓶子。

2.2.冷凝器 

冷凝器腔室由能够保持极低温度的线圈组成，温度范围为-70°C至-100°C，并通过管/接头与干燥室相连。由冰升华产生的水蒸气通过管进入冷凝器腔室，并在冷却线圈的表面冷凝。使用各种方法来冷却冷凝器，例如通过制冷剂的直接膨胀，可以提供从-45°C至-100°C的操作温度；液化气体如液氮，可以提供-70°C及以下的操作温度；以及循环盐水，可以提供从-50°C至-70°C的操作温度范围。从能源消耗的角度来看，液氮被认为更具成本效益。冷凝器有两种设计：内置和外置。外置冷凝器更受青睐，因为它们提供了一些优势：(1) 可以进行气压控制（等压阀），(2) 更快的周转时间，(3) 更少的油回流，(4) 温度更均匀，以及 (5) 更高的冰容量。 

2.3.真空系统 

一组冗余的干式真空泵与鼓风机结合使用，可以单独或并联运行，以降低腔室、冷凝器和相关管道中的压力。通过真空泵和氮气或其他气体的排放，维持所需的50–150 mTorr压力。 

2.3.1.腔室压力控制 

腔室压力控制系统包括含有架子的无菌真空腔室，产品放置在架子上，无菌氮气供应管道，气体排放控制阀，双串联氮气气体过滤器，冗余增压泵，冗余干式真空泵，冗余腔室MKS真空计，以及控制系统。气体排放控制阀是一个需要PID控制逻辑的元件。系统使用腔室MKS计作为PID控制腔室压力回路的基础。 

在冷冻干燥过程中，通过指定腔室压力设定点来控制腔室压力。在配方下载和周期初始化完成后，使用配方变量指示器来确定当腔室达到抽真空压力时，是否将关闭其中一个真空系统。系统根据在前一过程中未激活的泵选择并保持激活其中一个冗余干式真空泵。通过调节气体排放控制阀来实现指定设定点的压力控制，基于实际腔室压力与设定点压力之间的差异，实际腔室压力是在架子上方的腔室中测量的。如果实际压力大于设定点，则根据PID控制算法减少无菌氮气流量。同样，如果实际压力小于设定点，则根据控制回路调整请求额外的氮气。干燥室和冷凝器腔室中的压力通过压力计电容式压力计控制，并通过安装在腔室和冷凝器中的皮拉尼计进行监测。 

2.4.控制系统 

控制系统规格包括复杂的控制，包括完整的HMI和PL。控制系统的全局功能包括系统安全、通用批次管理、数据存储/归档、周期启动、配方下载、过程监控、设备监控、报警监控、报警响应、趋势监控、周期运行报告生成、E-Stop（紧急停止）、过程修改和设备维护。 

3.配方 

除了药物活性成分外，典型的冷冻干燥配方还包含几种通常称为辅料的成分，这些成分在配方中具有特定的作用。虽然经验法则是保持配方简单，但固体含量≤1%的稀溶液实际上无法冷冻干燥成蛋糕，因为没有足够的固体来形成结构。在那些药物活性成分效力强且需要少量的情况下，添加填充剂/填充物以提供机械强度和优雅的外观。填充剂可以是可结晶的（如甘露醇、甘氨酸）或无定形的（如蔗糖、海藻糖）。在蛋白质产品的情况下，配方中包含稳定剂以稳定蛋白质，使其免受冷冻、干燥和储存过程中遇到的压力。表面活性剂（如聚山梨酯20或80）用于在冷冻/解冻过程中稳定蛋白质，使其免受冰-空气或/和冰-溶液界面的影响。添加二糖（如蔗糖、海藻糖）和多元醇（如山梨醇、PEG）等冷冻保护剂到配方中，以保护蛋白质免受冷冻诱导的变性，而添加冷冻干燥保护剂到配方中以保护蛋白质免受冷冻干燥和储存过程中的干燥压力。在配方的塌陷温度较低的情况下，为了提高塌陷温度以便能够更温暖、更快地干燥并提高过程效率，添加塌陷温度增强剂（如环糊精、羟乙基淀粉）到配方中。一些蛋白质产品可能需要稳定剂来解决与蛋白质相关的化学不稳定性，如缓冲剂控制pH值、抗氧化剂解决氧化问题，以及螯合剂解决金属诱导的反应。 

配方和冷冻干燥过程是相互关联的，辅料的冷冻干燥特性影响配方的整体塌陷温度/Tg'，这反过来又决定了冷冻干燥过程条件的选择以及其干燥的效率或容易程度，因此，辅料的选择对于配方和过程的设计至关重要。这些辅料的选择、它们的重量比和加工条件对最终产品质量属性至关重要，并在“冷冻干燥配方设计的概念和策略”一章中详细描述。 

可以使用冷冻干燥显微镜（FDM）和调制差示扫描量热法（MDSC）分别直接测量塌陷温度和Tg'。单相多组分系统的Tg'也可以使用Fox方程从各个组分的Tg'值估算。

其中wi 是组分 “i” 的重量分数，Tgi 是纯组分 “i” 的玻璃化转变温度。方程 (1) 可以应用于含有两个或更多非晶组分的系统的 Tg′ 的确定，其中 Tgi 是水相组分 “i” 的 Tg′ ，
wi 是溶质相对于溶质总质量的重量分数。通过差示扫描量热法 (DSC) 确定的 Tg′ 值比使用冷冻干燥显微镜 (FDM) 测量的实际
Tc 值低约 2-3 度。共晶系统是两种或更多晶态化合物的混合物，在最低的凝固温度下共同熔化。在晶态相构成基质主要重量分数的混合配方系统中，
Te 将是配方的关键温度。在冷冻干燥过程中，产品温度高于配方非晶相的 Tg′ 但低于晶态组分的
Te 将导致非晶相的塌陷；然而，晶态相将提供必要的机械支撑以维持蛋糕结构和优雅性。这是一种实现快速而稳健的冷冻干燥循环的有效策略，但需要评估在塌陷温度以上干燥对产品稳定性的影响。 

4.过程 

冷冻干燥过程分为三个阶段：冻结、一次干燥和二次干燥（图 2）。含有药物活性成分以及其他辅料（缓冲剂、稳定剂和填充剂）的液体溶液被填充到玻璃小瓶中，并放置在冷冻干燥机的温控架子上。冻结阶段从架子温度降低开始，通常从 -40°C 降至 -45°C，并保持几个小时，具体取决于填充体积，以确保水完全转化为冰并确保冰的完全固化。 

图 2 冷冻干燥各阶段事件的描绘

一旦所有小瓶都冻结，下一步就是进行一次干燥，这是一个升华阶段，压力降低到深度真空，通常在 60-150 mTorr 范围内。从下面的相图（图 3）可以看出，降低压力使得冰直接通过升华转化为气相。此外，还施加热量以加快干燥过程。一次干燥是冷冻干燥过程中最长的阶段，可能需要几天到一周的时间，具体取决于溶液中的成分以及腔室压力和架子温度的选择。由于架子之间以及架子内部的热传递差异，并非所有小瓶都能同时干燥，因此通过浸泡期来确保所有小瓶完成一次干燥，然后再进入二次干燥。在冻结阶段，并非所有水都转化为冰，因为在冻结过程中溶质浓度增加导致冰点降低。根据溶液的组成，仍有 10-15% 的水未冻结，它可以保持自由状态或与辅料结合。这部分水在二次干燥过程中通过加热去除，二次干燥在提高的温度下进行，通常为 25-40°C。 

图 3 水的相图-相曲线和三相点

4.1.冻结 

4.1.1.冻结和结晶过程的物理原理（改编自《生物制药药物-器械产品开发》一书中的章节） 

冻结和结晶过程中发生的物理化学变化和热事件取决于溶液的组成。图 4 展示了两种溶液的冻结曲线：纯水（ABCDE）和蔗糖水溶液（A’B’C’D’）。在纯水中，当温度从点 A 降低时，直到点 B 才形成核或临界质量的核。一旦形成核，结晶过程就开始。由于结晶是一个放热反应，熔化潜热被释放出来，温度从 B 升至 C。从点 A 到 B 的事件被描述为水在成核前经历的过冷度。这种过冷度取决于所采用的冷却速率以及水的纯度（无作为成核位点的颗粒），自由颗粒数量越少，过冷度越高。点 C，对应于 0°C，是纯水的平衡冰点，在这一点上，水继续结晶直到点 D。一旦达到点 D，所有的水都转化为冰，由于结晶过程完成且没有热量释放，温度开始下降到设定点 E。冻结时间通常被定义为从成核开始到晶体生长阶段结束的时间。在结晶过程中（从 C 到 D）形成的冰晶大小取决于过冷度：更快的冷却速率导致更高的过冷度和更小的冰晶尺寸（图 5）。一旦向纯水中加入溶质，就会预期到不同的冻结行为。含有溶质的溶液受拉乌尔定律的支配，该定律将溶液的蒸汽压与纯溶剂的蒸汽压联系起来，基于溶质浓度。图 4 展示了纯水和蔗糖溶液之间的关键差异。首先，B’与 B 在温度上不同；蔗糖溶液比 B 更早成核，因为蔗糖分子的存在，它们充当核。其次，C’的冰点温度不如 C 高，这是由于蔗糖存在导致的初始冰点降低。这两个事件都取决于溶液中溶质的浓度。此外，在含有溶质的水溶液中，观察到一种称为冷冻浓缩的现象。当水在冷却过程中开始转化为冰时，冻结前沿向前移动，留下溶质浓缩，导致富含溶质的区域。这些富含溶质的区域进一步降低自由水的冰点，并且这种现象随着冷却的继续而持续（C’D’），留下一些残留的未冻结水，无论冷却温度设置得多低。此外，随着冷冻浓缩的增加，自由水的粘度增加，这降低了系统的流动性和扩散特性，并抑制了结晶过程。冷冻浓缩过程建立了图 6 所示的冻结曲线。该曲线可用于预测在任何给定温度下的冰量，这反过来又是由溶液中溶质浓度引起的冰点降低的函数。

图 4 纯水（ABCDE）和蔗糖溶液（A’B’C’D’）的冷冻曲线

图 5 冷冻速率对冰形态的影响

图 6 混合物的冷冻曲线。

冰的重结晶/奥斯瓦尔德熟化 

奥斯瓦尔德熟化是一种现象，在加热和冷却过程中，较大的冰晶以较小冰晶为代价而变大。较小的冰晶不稳定，容易在温度波动下融化，这是由于冷冻箱的循环和/或自动除霜。由于较小的冰晶融化，冷冻浓缩相中未冻结水的量增加，这将在温度降低时重新冻结，但不会重新成核。

而不是形成新的冰晶，它们沉积在现有较大晶体的表面，因此总的晶体数量减少，平均晶体尺寸增大（图 7）。这一现象的优势被用于冷冻干燥，以实现冰晶尺寸的均一性，并促进较大冰晶的形成，从而加快干燥速度。

冷冻系统中玻璃态相的形成 

随着冷却温度的降低，水开始通过两步结晶过程形成冰：成核随后是扩展。随着温度的持续降低，水转化为冰，导致溶质在自由的未冻结水中浓缩。对于每种冰/未冻结相比率，存在一个平衡冰点温度，它是溶质浓度的函数。图 8 展示了平衡热力学过程模型，以相图上的平衡冰点（液相线）曲线为依据，从纯水的熔点（Tm）（0°C）到溶质的共晶温度（Te）。Te 是溶质被冷冻浓缩至其饱和浓度的点。如果溶质达到过饱和，则可结晶的辅料如甘露醇或甘氨酸将结晶并沉淀。其他溶质将保持非晶态，当达到临界溶质依赖浓度时，未冻结的非晶态冷冻浓缩物表现出受限的流动性。此时，系统的物理状态从粘弹性液体变为称为“玻璃”的非晶态固体。发生这种情况的温度称为最大冷冻浓缩系统的玻璃化转变温度（Tg′），相应的未冻结水和非晶态溶质浓度分别称为Wg′ 和 Cg′（图 8）。玻璃被定义为一种非平衡、亚稳态、非晶态、无序的固体，具有极高的粘度（例如，粘度系数范围从 10101010 到 10141014 Pa·s），作为温度和浓度的函数。玻璃化转变曲线从纯水的玻璃化转变温度（Tg）（-134°C）延伸到纯溶质的 Tg。平衡相图和动力学衍生状态图可以结合在一起形成补充状态图。图 8 展示了二元蔗糖/水系统的固/液共存边界和玻璃化转变曲线的补充状态图。在玻璃化转变线以下和右侧，溶液以非晶态玻璃状态存在，无论是否有冰存在，这取决于温度和所遵循的冻结路径。另一方面，在玻璃化转变线以上和左侧，溶液处于液态，无论是否有冰存在，这取决于温度。图 8 中的点 A 描述了室温下 20% 蔗糖的初始浓度，点 B 描述了 20% 蔗糖溶液的初始玻璃化转变温度（Tg）（如果溶液能够在不形成冰的情况下冷却到该温度）。在缓慢冷却蔗糖溶液时，成核和随后的结晶在点 C 开始。这是由于蔗糖的存在导致一定程度的过冷，从而在水作为冰被移除后启动冷冻浓缩过程。随着冰结晶的进行，溶质浓度的持续增加（水的移除）进一步降低未冻结水相的平衡冰点，其方式遵循液相线曲线（显示为路径 C）。浓度的增加导致玻璃化转变线向上移动，粘度迅速增加（路径 B），从而提高未冻结水相的 Tg。在 Te 处溶质的共结晶不太可能发生，因为蔗糖不是可结晶的辅料，因此冷冻浓缩继续超过 Te 进入非平衡状态，因为溶质变得过饱和。当达到临界溶质依赖浓度时，未冻结的液体表现出非常受限的流动性，未冻结水相的物理状态从粘弹性液体变为脆性的非晶态固体玻璃。在 Tg′ 处，过饱和溶质由于分子运动减少而表现出固态特性，这负责了平移和非旋转运动的巨大减少。正是这种固有的低流动性低于 Tg′ 决定了蛋白质产品应在低于其Tg′ 的冷冻状态下储存。从玻璃态升温至高于Tg′ 的温度提供了巨大的流动性增加和扩散，不仅由于非晶态到粘性液体转变的影响，还由于小冰晶几乎同时融化导致的稀释增加（Tg′ = Tm′）。分子重排的时间尺度随着 Tg 的接近而不断变化。因此，通过最小化储存温度和 Tg′ 之间的 ΔT 可以获得一些增强的稳定性，这可以通过降低储存温度或通过冷冻方法或配方增强 Tg′ 来实现。因此，对玻璃化转变温度的了解为分子扩散和反应性提供了明确的指示，因此，为货架稳定性提供了依据。 

4.1.2.冻结过程对蛋白质溶液的影响及变性模式 

冻结过程可以通过三种机制使蛋白质变性：（1）冷冻浓缩，（2）冰面变性，（3）冷变性。 

1. 冷冻浓缩冻结的目的是将温度降低到溶液完全固化的程度，从而实现升华并阻止导致蛋白质在液态下降解的反应。当溶液冷却时，液体可能会过冷到远低于平衡冰点的温度，特别是在小瓶和小容器的情况下。在足够的过冷条件下，冰的成核迅速进行，系统快速冻结。在大规模容器中冻结大量溶液时，冻结缓慢进行，随着液态水转化为冰，蛋白质和配方辅料逐渐在冰晶之间的区域浓缩。在初始冰成核和结晶后，产品随着水持续转化为冰而冷却。随着这种情况的发生，剩余液相中的水量减少，剩余溶液中溶质的浓度增加。这种冷冻浓缩效应导致蛋白质浓度增加，从而显著增加分子碰撞的概率。蛋白质分子之间的双分子碰撞可能导致蛋白质通过聚集变性。例如，尽管温度从 5°C 降低到 -40°C 会显著降低速率常数，但由于浓度增加导致的浓度因子增加的影响更为显著，从而导致反应速率的净增加。如果配方中存在离子盐和缓冲物种等辅料，它们也会在冻结过程中浓缩。例如，在冻结过程中，含有 0.15M NaCl 的配方在与冰形成共晶之前会增加到 6M NaCl。蛋白质暴露于高离子强度可能会导致天然构象的不稳定性。此外，必须考虑冻结对缓冲选择的影响。缓冲剂被包含在配方中以帮助维持稳定的 pH。然而，在冻结过程中，溶解度的降低与浓度的同时增加可能导致缓冲组分的选择性结晶并导致 pH 的剧烈变化。经典例子是磷酸钠缓冲系统。它由于碱性组分的结晶而显示出约四个单位的 pH 剧烈下降。另一方面，磷酸钾系统在冻结时显示出 pH 的增加。减轻冷冻浓缩效应的策略 1.冰前沿速度应高于溶质的扩散率，以便蛋白质分子/溶质被冻结前沿捕获。这可以通过较短的冻结路径长度和高效的外部热传递相结合来实现。2.增加传热流体与产品之间的温差，从而缩短冻结路径长度。3. 最小化产品在冷冻浓缩阶段的停留时间。4. 在已知范围内控制冻结速率。5. 使用小规模容器以实现高效的热传递和快速的液-固相转变。6. 在冻结时不要混合。在解冻时混合，并以混合的方式实现均匀熔化。 

2.冰-液界面变性通过色氨酸残基的磷光寿命衰减，证明了蛋白质水溶液的冻结导致由于冰-液界面变性导致天然构象的扰动或松动，这通常导致二级和三级结构的丧失。在某些情况下，这种变性在冰融化后大部分是可逆的，在其他情况下，观察到活性的显著丧失。这种变化被认为取决于与冰平衡的液态水的残余体积以及冰的形态。

最小化冰-液界面的策略 

1.避免过度过冷，这会导致闪蒸成核和较小的冰晶。2. 优化冻结速率以实现低冰表面面积。3. 研究使用配方成分以避免表面相互作用。添加如多元醇和二糖（例如山梨醇、甘油、蔗糖）等冷冻保护剂和表面活性剂可以显著减弱甚至消除扰动。 

3.冷变性 

虽然一些蛋白质在冷冻过程中活性损失很小或没有可测量的损失，但冷冻过程会不可逆地使其他蛋白质失活。正如蛋白质在高温下发生热变性一样，蛋白质在极低温度下也会自发展开，称为“冷变性”。这在一定程度上是因为在冷冻过程中产生的不适宜环境。如上所述，随着溶质物种的浓缩，离子强度增加，pH值可能发生偏移，最重要的是，稳定蛋白质在水中天然构象的“疏水相互作用”会随着大量水从蛋白质相中移除而减少或消除。变性态与天然态之间的转变由焓变（ΔH）、熵变（ΔS）和吉布斯自由能变（ΔG）的变化通过以下方程描述：

吉布斯自由能与破坏蛋白质分子结构所需的工作量有关，用于描述蛋白质的不稳定性。吉布斯自由能方程呈抛物线形状（图9），这表明高温和低温变性在热力学上都是可能的。蛋白质在其天然状态温度(Ts)时的最大稳定性发生在天然态与变性态之间的熵差为零时。这意味着稳定性主要取决于天然态与变性态之间的焓差。可以通过微热量法或调制DSC作为温度的函数来确定转变的焓。由于吉布斯自由能曲线在Ts以下的下降部分可能低于0°C，因此实验上确定冷变性并不容易。尽管冷变性在蛋白质药物中并不广泛报道，但它仍然是一个可能性。由于冷冻浓缩效应和冰-液界面吸附导致的蛋白质变性可以通过优化关键冷冻参数来消除或减弱。如果冷冻过程中蛋白质变性的原因是冷变性，则添加少量的“排斥溶质”之一，称为冷冻保护剂（氨基酸、多元醇、糖和聚(乙烯)乙二醇），在摩尔浓度下将增加变性的自由能。因此，通过溶质从蛋白质表面的优先排斥，蛋白质受到保护，免受冷变性。最小化冷变性的策略 1. 增加冻融稳定性的配方添加剂：(a) 热力学稳定剂，(b) 冷冻保护剂，(c) 玻璃形成物质 2. 快速液-固相转变 

4.1.3.冷冻速率

冷冻阶段的主要目的是将水转化为冰并实现冰的完全固化。为了实现完全固化，配方溶液需要至少冷冻到Tg’以下5-10°C，并在此保持至少1-2小时，具体取决于填充体积，以确保水的完全结晶。未能实现这一点可能会导致在初次干燥期间施加真空时蛋糕被抬起，如图1所示。在冷冻阶段形成的冰晶的形态和大小影响后续冷冻干燥阶段的性能。这两个特征都取决于冷冻协议，如冷却速率和退火时间和温度。 

冷冻过程由两个参数特征化，过冷度和冰晶结晶速率。过冷度，也称为过冷度，是平衡冰点与溶液中首次形成冰晶的温度之间的差异。它取决于冷却速率和粒子环境。冷却速率越快，过冷度就越高。它是冷冻干燥的一个重要参数，因为它决定了核的数量，从而决定了冰晶的数量，进而决定了冰晶的大小，因为冻结的总水量是固定的。冰晶升华后留下孔隙，冰晶的大小决定了孔隙的大小，这影响/影响质量传递速率/干燥速率。因此，过冷度越高，冰晶的尺寸就越小，对质量传递的阻力就越大，初次干燥时间就越长，二次干燥时间就越短。由于二次干燥是一个脱附现象，取决于比表面积，冰晶的尺寸越小，比表面积就越大，二次干燥就越快。 

过冷度和冰晶的大小也将影响产品质量，因为蛋白质倾向于在冰/空气界面变性，冰晶的数量越大，易变蛋白质界面变性的可能性就越大。此外，冷冻协议影响辅料的物理状态及其在配方中的预期作用。某些辅料根据分子结构、溶解度、浓度以及其它配方成分的存在等因素，要么保持无定形，要么结晶。 

第二个冷冻参数，冰晶生长速率决定了产品在冷冻浓缩流体状态下的停留时间。如上所述，正是在冷冻浓缩状态下，所有有害反应都发生，因此，通过快速的冰晶生长速率来最小化产品在该阶段的停留时间是明智的。一般来说，在冷冻过程中，热去除速率决定了冰晶生长速率。在安瓿瓶冷冻干燥中，由于热去除通过安瓿瓶底部发生，可以做三件事来加快冰晶生长：(1)低搁板温度，(2)小填充体积-容器面积比（即小填充深度），以及(3)容器底部与冷冻干燥机搁板之间良好的接触。冷冻协议的另一个重要方面是不要将温暖的安瓿瓶放在冷搁板上，因为这将产生具有两个不同蛋糕的产品，因为底部的溶液将以更快的冷冻速率冻结，而安瓿瓶的上部将随着冷冻前沿从底部到顶部的移动而以较慢的速率冻结，特别是在填充高度较高的情况下。因此，建议将搁板预冷至-5°C，并在冷却至低搁板温度之前让安瓿瓶平衡至-5°C，以产生安瓿瓶内均匀的过冷度和均匀的蛋糕结构。 

4.1.4.退火

退火作为冷冻协议中的热处理步骤，有两个原因之一，要么通过称为奥斯特瓦尔德熟化的现象实现更大的冰晶尺寸，以促进更快的均匀/均匀的初次干燥，要么实现可结晶辅料如甘露醇和甘氨酸氯化钠的完全结晶。奥斯特瓦尔德熟化是一种大冰晶以小冰晶为代价生长的现象。无论意图如何，在这两种情况下，溶液都需要在Tg’以下10度冷冻，并在Tg’以上至少10度加热和退火，以提供移动性和生长成晶体的核。可以通过DSC、XRD和/或FDM确定最佳温度和时间。然后可以使用几种技术确认完全结晶，包括(1)Tg’退火温度曲线，(2)在冻结系统中亚稳熔化吸热下的面积，(3)在干燥粉末系统中膨胀剂熔化吸热下的面积，和/或(4)在DSC上加热干燥粉末时没有放热。

4.1.5.热电偶对冷冻速率的影响 

通常，在开发阶段将温度探头/热电偶放置在安瓿瓶内以监测产品温度。含有热电偶/传感器的安瓿瓶经历较小的过冷度，导致在较低温度下成核冰晶，比没有温度传感器的安瓿瓶冷冻得更快，导致冰晶尺寸较大，在升华后留下较大的孔隙，对质量传递的阻力较小，因此在较低温度下冷冻干燥，干燥时间比其他安瓿瓶短。因此，含有热电偶的安瓿瓶不被认为代表整个批次，因此，为其余安瓿瓶分配了10-15%的浸泡时间以赶上非热电偶安瓿瓶，并补偿干燥时间的偏差。这种效应在制造过程中尤其显著，其中无颗粒环境是由于100级区域。在安瓿瓶中放置温度传感器引入了显著更高水平的异质成核位点，从而导致在比没有温度传感器的安瓿瓶中更低的温度下冰晶成核（见图10）。此外，监测安瓿瓶在搁板上的安瓿瓶阵列中的位置也是记录代表性数据的一个重要因素。

 图 10 冷冻偏差的实验观察。

4.2.初次干燥 

冷冻干燥过程中的初次干燥阶段被认为是时间最长的阶段。通过正确选择搁板温度和腔室压力来理解和优化此阶段是设计高效过程的核心。在快速干燥速率和产品优雅度之间（在某些情况下是降解）取得适当的平衡是很重要的（避免产品塌陷至关重要）。干燥速率或升华速率由下面说明的简单方程控制，

dm/dt 是质量变化率，与驱动力成正比，即冰在冷冻产品温度下的蒸汽压 P0 与腔室压力 Pc 之间的差值成正比，与质量传递成反比，质量传递表示为由于产品 Rp 和塞子 Rs 的阻力之和。初级干燥期间的升华速率取决于产品阻力 Rp，而产品阻力又取决于产品的横截面积（即使用的容器内径 Ap）、产品的性质（固体含量和辅料的性质）以及干燥产品的厚度。因此，初级干燥期间产品阻力随着干燥层厚度的增加而增加（图 11）。在每个温度下，干燥时间大致与填充深度的平方成正比，而在 40°C 以下的目标温度下干燥填充深度为 2 厘米的产品变得具有挑战性。因此，快速冷冻干燥需要较高的目标产品温度和较小的填充深度。

图 11 干燥层厚度作为产品阻力的函数

4.3.二次干燥

与初级干燥类似，产品需要在低于塌陷温度的情况下进行干燥，以便在保留蛋糕结构的同时进行干燥。二次干燥期间的塌陷温度大多是产品的玻璃化转变温度 (Tg)。在初级干燥阶段结束后立即暴露于二次干燥的高温下，存在结构塌陷的风险，因为此时仍会有 5-15% 的残留水分，具体取决于配方成分。如果系统是非晶态的，则残留水分含量预计会偏向较高的一端，否则在晶体系统的情况下预计会偏向较低的一端。

由于水作为增塑剂会降低 Tg，因此初级干燥结束时产品的 Tg 会相当低，并且随着水分的去除而急剧提高，如图 12 所示。因此，建议以 0.22°C/min 的速率逐渐将初级干燥的搁板温度提高到二次干燥的搁板温度。在初级干燥期间使用低腔室压力的概念相当合理，因为升华速率与 P0–Pc 成正比。然而，据报道，二次干燥对腔室压力在 0–0.2 Torr 范围内不敏感，但无论是固体中的扩散还是固体-蒸汽界面处的蒸发是干燥非晶态固体的质量传递过程中的速率限制步骤，这表明相对较高的腔室压力 (0.1–0.2 Torr) 将是有用的。

冷冻干燥的主要目标之一是提高产品在液态时具有边缘稳定性的产品的储存稳定性，而二次干燥条件的设计是其核心。蛋白质或非蛋白质产品的稳定性取决于其流动性，因为流动性支持反应性，而流动性又取决于产品的残留水分。由于水分影响玻璃化转变温度 (Tg)，并且流动性与 Tg 相关，因此必须以这样的方式针对残留水分，即 Tg 值显著高于产品在运输和储存过程中将暴露的温度。需要确定可能残留在产品中而不影响产品稳定性的目标残留水分值。通过将冻干产品暴露于对应于不同相对湿度的饱和盐溶液中进行经验水分研究，并创建水分吸附等温线[有关水分研究的详细信息，请参阅“冻干产品水分研究设计”一章]。最佳残留水分水平相当具体，并且因产品而异，通常对于蛋白质产品小于 1% w/w，对于疫苗在 2% 至 3% 之间。

二次干燥的优化涉及两个过程参数：温度和时间。产品在二次干燥期间可以暴露的最大温度因配方而异，并且与分子稳定性作为温度的函数有关。一旦确定了最佳温度，就可以通过使用“样品窃取器/提取器”在不同时间间隔从冻干机中提取样品而不中断冻干循环，并使用卡尔费休滴定法 (KFT)、热重分析 (TGA) 或近红外光谱法 (NIR) 测量水分含量来确定最佳的二次干燥时间。

在我们的经验中，我们发现以低温干燥较长时间比以高温干燥较短时间更能提供更好的水分均匀性。通常，对于热敏感分子和配方，二次干燥在 25–30°C 下进行 5–6 小时是足够的。对于某些配方，如在冷冻和/或初级干燥阶段形成甘露醇半水合物的甘露醇基配方，二次干燥被用作脱溶甘露醇半水合物的机会。在 50–55°C 的高温下进行 2–3 小时的二次干燥有助于消除甘露醇半水合物。

必须意识到，在储存过程中水分含量会增加，并且通常与塞子释放的水分有关。通常在高温储存几个月后观察到这种情况，这种塞子与产品之间的水分交换可能对稳定性产生重要影响。可以通过在蒸汽灭菌后对塞子进行广泛的高温真空干燥来解决塞子的水分转移问题。

4.4.过程控制

初级干燥通过控制关键过程参数——产品温度和升华速率来控制，而升华速率又取决于独立过程变量——搁板温度和腔室压力。

产品温度是热传递和质量传递之间的平衡，热量通过传导（搁板温度）、对流（通过气体分子与热搁板表面和冷瓶底部的碰撞）和辐射传递到瓶中和产品中。质量传递再次取决于腔室压力，因为质量传递的驱动力是冰的蒸汽压和腔室压力之间的差异。因此，产品温度由搁板温度、腔室压力、瓶子的热传递特性以及产品和半塞瓶的质量传递特性决定。

在冻干过程中需要监测和控制产品温度，因为它是一个影响产品质量属性的关键过程参数。

通常，在冻干工艺开发过程中，使用热电偶来确定产品温度，以便优化/调整输入参数——搁板温度和腔室压力，从而使产品温度低于目标产品温度以避免塌陷。在工艺验证过程中，热电偶也放置在搁板的不同位置和搁板之间的瓶子中，以验证和展示产品温度和干燥速率的均匀性。然而，在商业生产中，由于无菌性问题，将热电偶放置在瓶子中是不可行的，必须依靠过程的稳健性和验证数据。因此，含有热电偶/传感器的瓶子经历的过冷度较小，导致冰在较低温度下成核，比没有温度传感器的瓶子冻结得更快，从而导致更大的冰晶尺寸，升华后留下更大的孔隙，对质量传递的阻力较小，因此在较低温度下冻干，干燥时间比其他瓶子短。其次，由于搁板之间和搁板上的热传递变化，边缘处的热电偶数据将比中心处更温暖。因此，带有热电偶的瓶子不被认为代表整个批次。

由于使用热电偶直接测量和监测产品温度和过程存在上述限制，最近出现了间接测量产品温度的方法。压力计温度测量 (MTM) 是一种已开发的技术，用于确定升华前沿的产品温度，以及确定升华速率和初级干燥阶段的结束。它基于当腔室和冷凝器之间的阀门迅速关闭约 15 秒时的压力上升数据。压力上升数据被拟合到与热和质量传递相关的一组微分方程中，以获得 ce-蒸汽界面处的平均产品温度。它提供了整个批次产品瓶的代表性温度，而不会冒无菌性妥协的风险。其适用性已在实验室规模得到证明、展示和使用；然而，其在商业规模的适用性还远未达到。

LyoPAT 是另一种正在出现的技术，再次仅限于实验室研究，他们使用热通量传感器来测量和控制热传递动态，以便能够测量关键过程参数、质量流、产品温度、蛋糕阻力，并且另外，瓶子的热导率 (Kv) 和热传递参数（热通量）。

目前在实验室规模使用并在商业规模证明具有前景的另一种技术是可调谐二极管激光光谱法 (TDLAS)。基于 TDLAS 的传感器 LyoFlux 测量连接冻干机腔室和冷凝器的管道中的水蒸气浓度和气体流速。近红外光谱仪提供水浓度和气体流速的实时测量，这些测量用于确定管道中的水质量通量（克/秒/cm²）。将通量测量与管道的横截面积知识相结合，以确定离开产品干燥腔室的水蒸气流量（克/秒）。在产品干燥周期中对流量测量进行积分，以确定总共去除的水分（克）。通过结合质量流的称重确定和基于瓶子的冻干的热和质量传递的稳态模型，现在可以确定升华界面的产品温度、瓶子底部中心的产品温度、产品对干燥的阻力、残留水分含量、初级和二次干燥终点、瓶子热传递系数、连续确定冰层和干燥层厚度以及最大冻干设备能力：作为压力函数的质量流。

4.4.1.腔室压力控制和监测

腔室和冷凝器压力通过电容式压力计进行控制，该压力计安装在腔室和压力中。电容式压力计确定绝对压力并控制腔室压力。

腔室压力可以通过三种方式控制：(1) 通过打开和关闭 PTD 阀门使氮气泄漏到干燥腔室中，(2) 导通控制，以及 (3) 控制冷凝器温度。

控制氮气泄漏

常用的且首选的技术是控制氮气泄漏，其中PTD阀门连接到大气压力下的氮气源，并且在电容式压力计测量到的偏离设定点时，将无菌氮气泄漏到干燥室中。 

导通控制

它基于连接干燥室和冷凝器的管道入口处阀门的开启和关闭。在初级干燥期间效果良好，此时可以通过水蒸气流入冷凝器来控制压力；然而，在次级干燥期间，当升华速率逐渐减小，且没有水蒸气时，它将无法控制压力。干燥室压力将降低到系统所能产生的最终真空度，并且存在产品通过吸附挥发性顶部杂质或冷冻干燥机中的任何其他外来气体而受到污染的潜在风险，并剥夺了在相对较高的干燥室压力水平下进行次级干燥的机会，例如200 mTorr。 

冷凝器温度控制

控制干燥室压力的另一种选择是通过控制冷凝器温度，前提是冷冻干燥机提供冷凝器温度的精细控制选项，其中控制冷凝器温度控制冷凝器上冰的蒸汽压，从而控制干燥室中水的分压。通过氮气泄漏来提供压力控制的过程并不一定与通过控制冷凝器温度来控制压力的相应过程相同，然而，差异不预期具有实际意义。该过程的一个缺点是无法提供确定初级干燥终点的过程控制选项，因为它不会在过程从初级干燥过渡到次级干燥时产生气体组成的变化。 

4.4.2.冷凝器压力控制和监测

控制冷凝器压力对于控制干燥室压力至关重要，因为质量传递的驱动力是干燥室和冷凝器之间的压力梯度。冷凝器温度应该足够低，-50°C，以便在所需的设定点控制干燥室压力。 

应注意，具有非常高升华速率的激烈过程可能会使冷凝器过载，导致失去干燥室压力控制，导致产品温度升高，最终由于产品塌陷或冰融化而导致批次损失。这种现象被称为阻塞流或当它达到马赫1时，即水蒸气的速度达到声速时。 

过载的冷凝器也可能表现为冷凝器线圈上冰的不均匀堆积，这是由于制冷系统无法从快速冷凝的水蒸气（即，从非常高的升华速率）中移除热量，同时保持冷凝器板温度低。 

4.4.3.初级干燥终点的确定

在初级干燥期间需要做出的重要决定之一，作为过程控制的一部分，是何时停止初级干燥阶段并进入次级干燥。不准确的测量存在融化回流或塌陷的风险，因为仍然存在冰的情况下进入次级干燥会降低产品的玻璃化转变温度Tg并塌陷产品结构。因此，需要一些初级干燥终点的指示器以实现最佳过程控制。 

传统上，产品温度响应和皮拉尼规是最常用的初级干燥终点指示器，并且可以在实验室规模和商业规模上使用。当产品温度用作指示器时，初级干燥的终点是在最冷运行的瓶子（通常是中心或背面瓶子）产品温度接近搁板温度时确定的。由于包含温度传感器的瓶子运行较暖且不典型于整个批次，因此给予冷瓶子10-15%的浸泡时间以赶上暖瓶子。由于10-15%的确定是任意的，且在实验室规模上确定的可能无法转化为制造并且由于冷冻偏差而保持良好，因此使用产品温度传感器来确定初级干燥的终点远非准确。从皮拉尼规获得的真空数据被广泛用作更可靠的指示器，无论是在开发还是制造水平上。由于它是基于氮气的热导率，其是水蒸气的热导率的1.6倍，拐点或当值下降并等于电容式压力计时，表明气体组成从水变为氮气，暗示初级干燥的结束。 

另一种可用于测量蒸汽组成的敏感方法是通过具有露点或水的分压输出的电子湿度传感器。电子湿度传感器具有确定瓶子中残留冰少于1%的敏感度。 

5.稳定性

一般来说，稳定性按以下顺序增加：溶液

没有过程考虑的配方设计和没有制造能力和限制知识的过程设计是导致失败/不成功的放大和向制造的技术转移的主要原因。 

在冷冻干燥中，配方和过程是相互关联的。配方中的内容决定了过程，反之亦然，因此，选择配方的成分及其特性以了解它们在冷冻和干燥期间的物理状态和行为对于高效的冷冻干燥过程至关重要。材料特性和技术的细节在“冷冻干燥配方设计的概念和策略”一章中进行了介绍或总结。

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