肿瘤微环境已成为调节肿瘤干性的重要组成部分，并在细胞间的通信中起着关键作用。然而，这些现象背后的具体机制仍不清楚。24年1月发表在Theranostics杂志（IF12.4；Q1）的9个HBV-HCC患者的单细胞转录组研究发现了恶性细胞和巨噬细胞之间存在着双向交流，这种交流促进了肿瘤干性和M2极化的发生。此外，研究人员还通过体外和体内实验验证了名为S100A11的分子作为维持肝癌干性关键介质的的作用，并揭示了肿瘤浸润免疫细胞的功能轨迹。
恶性细胞和巨噬细胞之间的相互作用增强了HBV-肝癌的肿瘤干性和M2极化
测序平台：10X Genomics
分析内容：单细胞转录组测序，聚类分群，差异基因分析，细胞间互作分析，CNV变异分析，生存分析，功能富集分析，转录因子分析等
1.scRNA-seq揭示肝癌组织样本的主要细胞类型从9名未经治疗的肝癌患者中获取了新鲜切除的肿瘤组织样本，并将其制成单个细胞悬液后进行了单细胞转录组测序（fig1A）。通过对筛选后的细胞进行聚类和t-SNE分析，共发现了44个细胞簇，并根据典型标记基因和差异表达基因（DEGs）进一步划分为7种主要细胞类型（fig1B-D）。 fig1 scRNA-seq of hepatocellular carcinoma revealed major cell types
其中免疫细胞占总细胞数的比例约为65%，包括T细胞（约39.12%）和其他四种亚型（NK细胞、B细胞、TAMs和DCs）(fig1C,E)。此外，还发现了一小部分肿瘤相关内皮细胞和大约35.46%的癌症细胞。与之前的研究结果一致，免疫细胞在不同患者之间没有显著差异，但癌症细胞表现出异质性（fig1F）。值得注意的是，T细胞和巨噬细胞比例呈负相关关系（fig1G），这表明巨噬细胞可能抑制T细胞的肿瘤浸润。 fig1 scRNA-seq of hepatocellular carcinoma revealed major cell types通过对11,228个肝癌细胞进行无监督聚类分析，研究人员发现存在7个不同的簇（fig2A，B）。fig2 Identification of cancer cell subpopulationsGSVA分析发现C6簇参与干扰素-γ/α反应、IL-6/JAK/STAT通路、血管生成和上皮-间充质转化（EMT）的基因的高表达，并且这些都与肿瘤的维持和转移相关（fig2C）。研究人员利用SCENIC算法扫描并检查了转录因子结合位点以及转录因子和其潜在靶基因的共表达情况，发现C6簇中高度上调的NFE2L1和NFE2L3表达是癌症恶性的重要调节因素（fig2D）。 fig2 Identification of cancer cell subpopulations研究结果还表明，多样化的转录因子调控反映了肝癌内的异质性。利用TCGA数据库中的肝癌样本，根据C1-C7簇前10个聚类特异性基因标记表达对样本进行分层（fig2E）。结果显示，C6簇中相应标记基因的高表达与较差的整体生存率显著相关。这一发现表明，C6亚群的转录组特征与肝癌预后密切相关。
fig2 Identification of cancer cell subpopulations3.肝癌干性标志物在不同亚群中的差异及CD24/CD47/ICAM1亚克隆的鉴定
通过对7个不同的癌症细胞簇进行分析，发现其在功能和调节方面存在显著差异。一些肝癌干细胞标志物（CSC marker）如ALDH1A1和ANPEP在某些簇中广泛表达，而另一些标志物如CD24/CD47/ICAM1则仅在特定的簇中表达（fig3A-C）。
fig3 CSC-associated heterogeneity in HCC
其中，C6、C7簇被发现具有更高的干性特征得分（fig3D），这意味着它们可能具有更强的自我更新能力。结合步骤2的结果C6簇符合更高干性能力有更差预后的结果，C6簇值得被关注。研究发现C6簇主要来自两个患者（P8、P9），超过90％的癌细胞都表现出CD24/CD47/ICAM1三重表达的特点（fig3E）。通过免疫荧光染色证实了临床标本中同时表达CD24、CD47和ICAM1的存在（补充图）。这些结果为进一步研究肝癌干性及其生物学特性提供了重要的线索。
fig3 CSC-associated heterogeneity in HCC4.体内外功能实验验证了S100A11可作为下游干性调节因子通过对簇C6的基因表达谱分析等分析结果以及结合现有文献研究，锁定了S100A11为最佳候选因子，能够增强肝癌细胞的自我更新能力（fig4A）。为了验证这一假设，采用了稳定的基因敲除方法，在肝癌细胞系中建立了S100A11的稳定敲除克隆系，并对其自我更新能力和化疗耐受性进行了评估（fig4B-E）。结果表明，S100A11敲除显著降低了肝癌细胞的自我更新能力，并增强了其对化疗药物的敏感性。此外，还进行了体内实验，证明了S100A11在肝癌细胞中的作用，并提出了将其作为治疗靶点的可能性（fig4F,G）。
fig4 S100A11 enhanced cancer cells stemness both in vivo and vitro 5.肿瘤免疫微环境（TIME）中淋巴细胞和髓系细胞的功能轨迹重建首先，通过对14,008个淋巴细胞进行聚类分析，将其分为CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、循环T细胞、FGFBP2+NK细胞和KLRC1+ NK细胞等五组（fig5A,B）。其中，CD4+ T细胞富集了移植排斥和干扰素-γ响应通路中的基因表达，而CD8+ T细胞则具有诱导免疫相关正调节因子的表达特征，如IL-6/JAK/STAT3、p53和Wnt/β-catenin信号通路，这些通路与T细胞增殖和耗竭密切相关。此外，循环T细胞中还存在KRAS和EMT信号通路的富集。在NK细胞方面，将其分为高表达FGFBP2和KLRC1的两个簇，KLRC1+ NK细胞簇表现出TGF-β和NOTCH信号通路的上调表达，提示免疫代谢功能障碍，而FGFBP2+ NK细胞簇则表现为低表达的缺氧相关基因（fig5C）。fig5 Dissection and subclusters of lymphocytes/monocytes in HCC接下来，通过TF分析揭示了不同淋巴细胞亚群下的主要转录因子，例如EOMES、IRF8和IRF7在CD4+T细胞中被上调，而FOXO1和FOXP1在CD8+T细胞中被上调。值得注意的是，EOMES和IRF8参与Th1和Th17细胞极化的调控，而FOXO1则在CD8+T细胞中具有再激活和自我更新的功能。这些结果也揭示了不同淋巴细胞亚群之间的异质性（fig5D）。最后，进一步探究了髓系细胞的异质性。通过对5,568个髓系细胞进行分层聚类分析，将其分为10个子群，包括6个单核细胞和4种树突状细胞（fig5E）。在单核细胞方面，发现了LGMN和SPP1的高度共表达，已在各种具有促肿瘤和促纤维化特征的疾病中被报道。在DC方面，共鉴定了四种亚群，包括BDCA-1(CD1c)+型2经典DCs(cDC2)、BDCA-2(CD303)+浆细胞样DCs(pDCs)、BDCA-3(CD141)+型1经典DCs(cDC1)和LAMP3+DCs。前三种DC亚群已被广泛研究，而最近的一项单细胞研究表明，LAMP3+DCs存在于肝癌成熟状态中。同时，GSVA结果显示APOC3+单核细胞向51个标志物表达谱谱宽，表明这一簇中有大量基因被上调（fig5F,G）。同样，TF分析显示每个子群之间存在多样性，这表明它们的功能差异。 fig5 Dissection and subclusters of lymphocytes/monocytes in HCC
研究发现，巨噬细胞与肝癌细胞之间存在双向交流，通过释放不同的信号分子来促进或抑制肝癌细胞的生长和转移。为了揭示TAM极化与癌症干性之间的关系，我们根据M2标志物评分将TAM分为高表达M2（LGMN+和SPP1+的TAM）和低表达M2（其余TAM）（fig6B-D）。我们发现癌症细胞簇C6和高表达M2细胞之间存在59种独特的相互作用，但其他癌症细胞簇和低表达M2细胞之间没有（fig6B）。fig6 Interrogation of cell-cell communication between TAMs and cancer cells in HCC癌细胞和TAM之间的强联系通过GAS6-AXL/MERTK和THBS1-CD36/CD47/ITGA4/ITGB1/LRP1途径发生（fig6D）。更重要的是，研究结果表明，C6簇可驱动TAM向M2表型转化。结果一致表明，在HCC肿瘤中，CD24、CD47和ICAM1表达有更多的M2信号（fig6E），为我们的细胞-细胞通信结果提供了支持。 7.共培养体系证实了癌症干性和TAM极化之间的双向反馈回路该部分研究人员通过模拟模型和实验验证了肝癌干细胞和巨噬细胞之间的双向反馈机制。他们使用转膜共培养模型来研究肝癌细胞和THP-1衍生巨噬细胞之间的相互作用。通过对巨噬细胞的不同处理，如PMA、IL-4和IL-13以及IFN-γ和LPS等，可以形成不同类型的巨噬细胞。结果表明，M2-likeTAMs能够促进肝癌干性基因（C6簇癌细胞标志物）的表达（fig7A），而敲除S100A11则会抑制巨噬细胞向M2-like表型转化并增强M1巨噬细胞标志物的表达（fig7B）。此外，研究还发现，敲除S100A11能够减少肝癌肿瘤的质量，并显著增加M1样巨噬细胞的数量。这些结果支持了肝癌细胞和M2-like TAMs之间的双向反馈机制，并为进一步探索肝癌治疗提供了新的思路。 fig7 Reciprocal interactions between TAM polarization and cancer cell stemness by co-culture assays
肝癌患者肿瘤细胞存在异质性，发现了其中一种具有干性特征强且较差预后的肝癌细胞簇与S100A11基因表达水平密切相关。此外，肝癌细胞与其周围微环境中的巨噬细胞之间的双向交流可以影响肿瘤的生长和发展，癌症干性的维持更多的归因于M2极化，而不是TAMs的补充。这些发现有助于深入理解肝癌的发病机制，并为肝癌的治疗提供了新的思路。
文献索引： Reciprocal interactions between malignant cells and macrophages enhance cancer stemness and M2 polarization in HBV-associated hepatocellular carcinoma. Theranostics 2024, Vol. 14, Issue 2. 观看视频讲解更轻松![]()
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