又一位华人学者！《Nature》，《Cell》两篇文章发现CRISPR新系统的奥秘

Ailong Ke教授

9月4日，这一研究组的最新成果“How type II CRISPR–Cas establish immunity through Cas1–Cas2-mediated spacer integration”公布在Nature杂志上，提出了II型CRISPR系统逐步间隔序列整合的一个机制框架，这将有利于增加对II型CRISPR系统作用机制的了解。

细菌面对着来自病毒以及入侵核酸链质粒的不断攻击。为了在这样的攻击下生存下来，细菌和古细菌采用了多种防御机制，包括一种以称作为规律成簇间隔短回文重复(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat,CRISPR)的DNA元件为中心的适应性免疫系统。CRISPR DNA元件是由一些长度为30-60个核苷酸的“重复序列”组件构成，这些重复序列被长度变化为30-60个核苷酸的“间隔序列”（spacer）组件所间隔。

为了记住感染，CRISPR系统从入侵病毒DNA处抓取了一段短序列，将它直接插入到细菌基因组中。一些噬菌体DNA片段被储存在基因组的特定区域中；这些形成了免疫记忆。在随后的感染中，CRISPR利用这些序列构建出了与噬菌体遗传序列相匹配的短RNA链。连接这一RNA的蛋白质复合物随后鉴别出噬菌体DNA然后破坏它。

如果错误抓取自身DNA片段可导致细菌细胞罹患自身免疫疾病，攻击它自身的DNA，这对于细菌可能是致命的。那么CRISPR系统是如何知道将外源DNA而非自身DNA片段插入到免疫记忆中去呢？

之前的研究显示，细菌具有两种称作为Cas1和Cas2的蛋白——是CRISPR系统的组成部分，负责获取外源DNA片段。CRISPR系统成功地将质粒DNA整合到了细菌的基因组中，而“自身”DNA很少遭到攻击。保守的Cas1和Cas2蛋白能形成一种整合酶复合物：边上是Cas1二聚体，中间是一个Cas2二聚体。

对于已经研究得比较多的大肠杆菌I-E型 CRISPR系统来说，间隔序列取决于细菌的Integration Host Factor (IHF)，然而对于II-A型 CRISPR系统来说，这依然是个未解之谜。在这篇文章中，研究人员就通过分析链球菌的II-A型 CRISPR系统，发现了在间隔整合期间，Cas1-Cas2的四个结构快速捕捉成像，由此解析了这个关键的问题。

研究人员发现在靶标靶点过程中有三个重要的分子事件：首先Cas1-Cas2/prepace随机搜寻半结合位点，然后优先与前导侧CRISPR重复序列相互作用，催化一种亲核攻击，即将前导-近端重复序列连接到prepacer的3'-overhang上。此外，研究人员指出识别间隔序列的半结合位点需要DNA弯曲并完全整合。

这项研究提出了II型CRISPR系统逐步间隔序列整合的一个机制框架，这将有利于增加对II型CRISPR系统作用机制的了解。

今年7月，柯爱龙教授研究组公布了嗜热裂孢菌（Thermobifida fusca）的I型CRISPR复合体的近原子分辨率结构，并从中揭示了CRISPR-Cas3这一系统的作用机制。

研究人员利用生化技术和冷冻电子显微镜技术，得到了不同的功能状态下的稳定复合物结构，观察到了CRISPR复合物靶向目标DNA链，并准备通过Cas3酶切割DNA的全过程。研究人员表示这些结构有助于揭示多层错误检测的过程，这一过程可以防止出现意外的基因组损伤。

研究人员还发现在CRISPR-Cas3中，crRNA被添加到CRISPR蛋白复合物上，当CRISPR复合物发现PAM序列，就会让DNA呈锐角弯曲，迫使一小段DNA解链。这允许crRNA的一个长11nt的片段结合到靶DNA链上，形成“seed bubble”。这个结构能起到自动防故障装置的作用，检查靶DNA是否匹配crRNA，如果它们正确匹配，则气泡扩大，并且其余的crRNA与其相应的靶DNA结合，形成所谓的“R-环”结构。

一旦这种R环完全形成，这种CRISPR复合体就发生构象变化，将靶标DNA锁定。同时也让DNA的第二条非靶标链形成一个凸起，这样形成完整的R-环结构，就能被Cas3酶切割。