采用脱细胞视神经设计合成周围神经类组织修复缺损的坐骨神经组织结构恢复大鼠后肢感觉和运动功能

严重的周围神经缺损伴随着肢体感觉和运动功能的丧失，其在临床上的治疗策略仍具有挑战性。至今，修复周围神经缺损的金标准仍然是釆用自体周围神经移植。由于自体周围神经移植物的获取不可避免地造成机体额外损伤，因此需要模拟周围神经的组织结构设计合成一种类似周围神经移植物，解 决获取自体周围神经不足的临床问题。同时可以探讨该神经移植物的细胞与细胞外基质的互作机制，无疑具有重要的理论意义和临床转化前景。

近年来，由于合成生物技术的发展，已有釆用合成的脑类器官、脊髓类器官和脊髓类组织修复中枢神经的研究报道，但是缺少有关设计合成用于修复周围神经缺损的类器官/类组织的文献。因此, 本研究遵循组织工程模拟设计理念，采用合成生物技术在含有天然均匀纵向通道的脱细胞视神经支架(富含细胞外基质)内负载过表达神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3) 的基因工程雪旺细胞(Schwann cells, SCs)，在体外模拟周围神经组织结构制造一种富集层黏连蛋白(laminin, LAM 或 LN)和NT-3等生物活性因子的周围神经类组织(peripheral nerve tissueoid, PNT)，然后将其移植到坐骨神经的缺损处，试图诱导含有LAM或 LN受体和NT-3受体的神经元轴突在其中纵向穿越再生长，恢复瘫痪后肢的感觉和运动功能，并且探讨PNT移植物诱导坐骨神经再生的作用机制。

本研究在前期改良经典脱细胞技术的基础上，将新鲜猪视神经和猪坐骨神经分别制备成脱细胞视神经(decellularized optic nerve，DON)及脱细胞坐骨神经(decellularized sciatic nerve, DSN)，并比较这两种神经支架的结构特征。扫描电镜观察结果显示，DON横切面上具有大小及分布较为均一的多孔状结构，纵切面显示纵向直行通道，通道之间呈现横向小孔互通连，为通道间的物质交换提供可能；然而，DSN横切面上则为大小及分布较为不均一的多孔结构 ，纵切面上多显示出分布不规则、宽窄不一的纵向和斜向通道。此外，DON的平均孔径率要比DSN大，这可使到DON有更多的基因工程雪旺细胞定植和诱导神经元轴突集束再生长的空间。借助蛋白组学技术分别对DON和DSN进行差异蛋白分析，结果发现在DON和DSN中与促进轴突再生高度相关的细胞外基质（ECM）蛋白成分相类似，表明DON也具有DSN那样的ECM。然而有趣的是，在DON中却含有特异性高水平的层黏连蛋白C3(LAMC3)及四型胶原A6(collagen IVA6，COL4A6)。据后续分析揭示LAMC3可以黏附再生的轴突继续生长（图1）。

图1.猪脱细胞视神经（DON）和猪脱细胞坐骨神经（DSN）支架的制备及其结构和主要蛋白成分特征。a）示意DON和DSN制备的流程图。b）呈现DON和DSN的扫描电镜结构特征。c）示意DON和DSN蛋白组学的检测图。d和e）呈现D ON和DSN中与分子黏附（红色）和轴突再生（绿色）相关的差异表达蛋白GO亚型富集图，其中纵坐标红色方框内为重点关注的蛋白亚型，横坐标表示各蛋白亚型的数量。

通过分析设计合成的PNT发现，其中的DON纵向通道管壁独特的生物活性基质成分LAMC3或LN，能够通过与基因工程雪旺细胞(NT-3-SCs)分泌的NT-3结合，形成一种富集NT-3沉积区域。位于PNT的NT-3-SCs亦可以通过其细胞表面的NT-3受体TrkC结合自分泌的NT-3: 一方面促使NT-3-SCs能够 更好地定植在沉积NT-3的区域内，形成一种PNT的动态生物活性龛位; 另一方面NT-3与TrkC(配体与受体)的互作进一步激活NT-3-SCs更好地存活并分泌多种神经营养因子，形成诱导神经元轴突集束再生长的微环境和结构基础（图2）。

图2. 基因工程雪旺细胞(NT-3-SCs)以及设计合成的周围神经类组织（PNT）。a）示意在体外将NT-3-SCs种植到含有纵向通道的脱细胞视神经支架内合成PNT的模式图。b）和c）呈现NT-3-SCs在PNT的分布状态，白色箭头示定植的NT-3-SCs成束样或聚集成串珠样生长。d） 在PNT纵切面上显示其纵向通道管壁的层黏连蛋白(LN，红色箭头示)。e) 可见NT-3-SCs的周围分布着LN与NT-3共定位的荧光染色条索状沉积物(紫色箭头示)。f）呈现NT-3-SCs在PNT内分泌NT-3的状态，白色箭头示NT-3沉积在NT-3-SCs的周围。g) 表达TrkC的NT-3-SCs周围分布有LN。h) 示LAMC3或LN与NT-3结合的计算机模拟图。l）在PNT的扫描电镜图中，红色箭头示定植的NT-3-SCs。j）展示PNT内NT-3沉积在LN上，以及NT-3-SCs通过表达的TrkC与NT-3结合定植在LN上的模式图。

随后，将上述的PNT移植到大鼠坐骨神经1 cm长的缺损处，移植手术后动物存活8周。通过对动物的行为学测试和神经相关组织及其功能检测，结果显示，PNT移植组的坐骨神经指数、患肢旋转角度和机械痛觉敏感度测试值接近于自体周围神经移植组(P > 0.05)，与其它移植对照组比较均有明显 的改善(P < 0.05)。PNT移植组的神经电生理潜伏期检测值接近于自体周围神经移植组，波幅和坐骨神经传导速度检测值与自体周围神经移植组比较仍有明显差异; 但是, 与其它移植对照组比较有明显的改善。神经相关组织检测表明，与其它移植对照组比较，PNT移植组能够促使再生轴突较快穿越坐骨神经缺损/移植处到达靶组织并重新形成髓鞘，从而改善由于失去神经支配的靶皮肤以及肌肉组织的感觉和运动功能。顺行和逆行示踪神经组织表明，移植的PNT与宿主坐骨神经有较好的组织相容性，无论在移植物内还是在坐骨神经缺损/移植处的远端，腺相关病毒(AVV)标记的背根节(DRG)神经元及其再生的降钙素基因相关肽(CGRP)阳性轴突均能够特异性表达TrkC。

将PNT移植组和单纯脱细胞视神经（DON）移植组支配后肢坐骨神经缺损/移植侧的DRG进行转录组学检测，分析其神经元轴突再生的潜在分子作用机制。结果揭示PNT移植物在坐骨神经缺损/移植处提供生物物理桥接诱导DRG神经元轴突再生长的基础上，其中的基因工程雪旺细胞分泌的NT-3富集 在纵向通道管壁层黏连蛋白(LN或LAMC3)上，这两种蛋白分子分别诱导DRG神经元及其轴突表达与它们相结合的受体TrkC和整合素aVβ6(Integrin aVβ6)，由此激活神经元与内在驱动轴突再生相关的PI3K/AKT信号通路（图3），提升轴突长距离再生的效能。

图3. PNT移植促进感觉神经元轴突长距离定向再生的潜在分 子作用机 制 。a)显 示PNT移植组和DON移植组的L4−L6 脊髓节段背根节(DRG)mRNA组学分析韦恩图。b)显示基因集富集分析(GSEA)PNT移植组比DON移植组评分较高的关键分子信号通路图。c)显示PNT移植组和DON移植组中霍乱毒素亚 单位 B(CTB)标记神经元(白色箭)中表达TrkC(白色箭示)和c-fos(红色箭示)。d)显示LN与Integrin aVβ6结合的计算机模拟图以及PNT移植物中LN和Integrin aVβ6的表达状况。e）显示差异表达基因与上述三大模块相关的关键分子信号通路富集分析气泡图。f)显示PI3K-AKT信号通路关键差异表达基因的蛋白与蛋白互作网络图。

总而言之，本项研究揭示了一种基于合成生物技术的周围神经类组织可以修复缺损的坐骨神经结构与功能, 这时空可能涉及诱发NT-3与受体TrkC细胞以及层黏连蛋白与受体整合素aVβ6轴突互作与信号转导的周围神经类组织在促进神经元轴突靶向再生中的趋化、黏附和内在驱动三重机制：(1)周围神经类组织中的层黏连蛋白可以与NT-3结合形成富集NT-3沉积区域，创建有利于表达TrkC的基因工程雪旺细胞定植和生长的生态位。同时，周围神经类组织持续分 泌NT-3，可诱导表达TrkC的神经元轴突再生进入到坐骨神经缺损/移植处。(2)在缺损/移植处的周围神经类组织内，其中的层黏连蛋白也可以直接黏附再生轴突上的整合素aVβ6，继续引导轴突的靶向再生。(3)再生轴突与周围神经类组织之间TrkC与NT-3以及整合素aVβ6与层黏连蛋白的互作与信号转导，协同激活发出再生轴突的神经元PI3K-AKT信号通路，增强其内在驱动轴突再生的能力，实现轴突长距离定向生长并促使靶组织重新获得神经支配，恢复肢体的感觉和运动功能。

中山大学中山医学院曾园山教授 ： 医学博士、博士研究生导师。在华西医科大学(现四川大学)攻读博士研究生，在美国印第安纳州大学医学院做博士后研究。现任中国脊髓损伤修复与功能重建创新联盟委员和江苏省神经再生协同创新中心学术带头人。曾获得国家自然科学基金委11项目(其中有重大项目课题、重点项目、联合基金项目、海外学者合作项目、面上项目)和国家重点研发计划项目等资助。至今，在国际学术期刊上发表学术论文80篇，其中发表在有影响力的期刊Biomaterials、Advanced Science、Advanced Functional Materials、Bioactive Materials、Chemical Engineering Journal、Stem Cell Reports和Journal of Neuroscience等。

广东省人民医院李戈副研究员 ： 硕士研究生导师，广东省（广州市）心脏病发病机制与精准防治重点实验室副主任，兼任南方医科大学、华南理工大学等国内知名大学硕士研究生导师。广东省自然医学研究会干细胞与中医再生医学委员会青年委员会副主任委员、，中国研究型医院学会神经再生与修复专业委员会脊髓损伤修复学组委员、广东省医学会医学科研实验室建设与管理学会青年委员、广东省生物医学工程学会生物3D打印与再生医学分会青年委员会委员。专注于多模式脊髓损伤修复策略研究、干细胞及组织工程技术修复神经系统损伤的转化医学及基础研究。参与国家自然科学基金重大专项课题，主持国家自然科学基金面上项目、青年基金、广东省自然科学基金等多个国家及省部级项目。共发表SCI论文39篇，其中包括BIOMATERIALS，CHEM ENG J 和BIOACT MATER等极具影响力的国际期刊。出版英文专著1部（ISBN：978-0-12-820262-3）。获国家发明专利授权1项和国家实用新型专利授权4项。曾获第四届广东医学科技奖一等奖。

中山大学附属第一医院许扬滨教授 ： 主任医师，医学博士，博士研究生导师，中山一院整形修复外科学科带头人，中国整形美容协会瘢痕分会副会长、《中华显微外科杂志》顾问，曾任广东省医学会整形外科分会主任委员、广东省医师协会整形外科分会副主任委员、中华医学会整形外科分会委员、中国医师协会整形外科分会常务委员、《中华显微外科杂志》副总主编。曾经前往日本北海道大学、美国波士顿麻省总院、美国达拉斯西南医学中心和Shriners医院整形外科学习交流，并且到Dr.Donelan的美容诊所学习，在乳房整形再造方面有较高的造诣，擅长游离皮瓣、周围神经损伤的修复、面瘫、器官再造、耳再造、眼部美容整形手术。研究领域主要为周围神经的再生修复研究，主持多项国家自然科学基金、广东省自然科学基金项目。

中山大学附属第一医院 朱昭炜副主任医师 ： 医学博士，硕士研究生导师，斯坦福大学骨科实验室助理研究员。广东省医学会显微外科分会常务委员、中国康复医学会修复重建外科分会瘢痕学组委员、中国整形美容协会精准与数字医学分会理事、广东省整形美容协会整形外科分会委员、广东省医学会健康传播自媒体联盟委员。研究方向为周围神经损伤修复基础研究、病理性瘢痕发病机制研究，面瘫与乳房整形临床研究，显微外科技术改进与推广研究。作为客座编辑组建Frontiers in Cellular Neuroscience专刊，并出版英文专著1部（ISBN：978-2-83251-399-6），受邀前往哈佛大学医学院、加州大学欧文分校访学交流。在Biomaterials、Annals of Biomedical Engineering等国际期刊发表高水平论文10余篇，主持有国家自然科学基金、广东省自然科学基金、中山大学青年教师培育项目等多个科研项目。组织整形美容缝合培训、显微外科技术培训班，入选Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine杂志封面，并获评2022年度中山一院本科教学新秀。

中山大学附属第三医院何波副主任医师 ： 医学博士、硕士研究生导师，斯坦福大学博士后、California Hospital Medical Center访问学者。中国医师协会骨科医师分会上肢创伤学组委员、第一届中国医师协会显微外科医师分会全国委员兼周围神经修复专业委员会委员、广东省医学会显微外科分会委员。《中华显微外科杂志》编委，欧洲Bentham科学出版社大使，Journal of Orthopedics and Muscular System 编委。擅长周围神经损伤、骨盆及四肢骨折的救治、肢体各种骨与软组织矫形术。在周围神经损伤修复重建基础与临床领域有较深入研究，协助刘小林教授开展多中心临床研究，证实去细胞同种异体神经是一种安全有效的周围神经缺损移植物。2016年在美国费城作为组委举办了2nd International Conference & Exhibition on Tissue Preservation and Biobanking会议。2021年在国际上首次制定了带血运的复合组织深低温冷冻保存技术的临床指南（入选杂志封面），发表在J Tissue Eng Regen Med 。现发表高水平论文30余篇（包括1篇Editorial），其中作为通讯作者发表在具有国际影响力的期刊有Biomaterials、Annal of biomedical engineering、Bone、Plastic and Reconstructive Surgery等，作为主编组建Frontiers in Cellular Neuroscience专刊，并出版英文专著《The function of Schwann cells in peripheral nervous system》（ISSN：1664-8714），副主译专著1部、参加专著编写2部，主持省部级各类科研项目5项。