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时空机制研究怎么创新?16分Cell子刊揭示“核糖体排队”秘密!

课题指南针  · 公众号  ·  · 2023-10-09 17:45

正文





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蛋白质是参与生命活动的重要物质,目前大部分热点研究也围绕蛋白质的生成、翻译及翻译后修饰展开。
经典理论认为在蛋白质翻译后,许多蛋白质才能定点转移到细胞的不同区域发挥功能

但最近发表的这篇Cell子刊文章则证明了一条全新的研究路线mRNA的位置和翻译速率也可以通过调节蛋白与特定相互作用伙伴的结合来决定蛋白的靶向性

用个人性化的有趣比方来形容:蛋白质还没“毕业”,其实已经通过出身和成长速度,定好未来的工作“单位”了。

文章主要围绕“NET1蛋白质”讲述了这样一个故事:

  • NET1 mRNA外周定位和快速翻译使更多NET1蛋白在细胞质内滞留(机制为NET1蛋白与膜相关支架蛋白CASK结合)。

  • 相反,核周mRNA定位较慢速翻译有利于蛋白入核(机制为与importin蛋白的结合)。

研究表明,蛋白质合成的位置和翻译延伸的速率作为一种“选择伙伴”机制协同作用,对蛋白质的分布和功能产生持续的影响。

文章内容概述图

01
研究背景

NET1是一种鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)可激活RhoA GTP酶,并分布在细胞核和细胞质中

细胞质NET1调节RhoA控制细胞骨架和细胞迁移,而核NET1可控制细胞对DNA损伤的反应。翻译后修饰可以改变NET1的分布和功能,但NET1 mRNA定位额外靶向迁移到细胞的外周突出细胞质区域,人们对这种定位调节机制还知之甚少。

研究发现外周NET1 mRNA在肿瘤细胞内的不同位置,可以影响癌细胞侵袭能力,但外周mRNA定位和翻译如何影响NET1蛋白功能尚不清楚

因此,这篇文章探究了NET1 mRNA位置与其翻译速率相结合,可以通过有利于与特定伴侣结合来影响竞争结构域确定新合成蛋白质靶向的能力

这种基于RNA的伴侣选择机制提供了一种控制蛋白质功能的手段

02
研究内容
01
工具构建:改变NET1 mRNA定位

NET1 mRNA定位到细胞外围是一个活跃的过程,需要一段特定序列(GA含量高)。

因此,作者设计特定序列,可显着降低外周NET1 mRNA定位(图1A),并证明这种方式的严谨性:NET1 mRNA或蛋白质水平无明显变化,(图1B),且对NET1具有特异性

为操作NET1 mRNA定位,作者构建稳转株(图1C),成功使NET1 mRNA在核周分布(图1D)且NET1 mRNA同样稳定,并且在外周和核周位置以相似的效率翻译(图1E)

图1. 改变NET1 mRNA在外周和核周区域之间的定位

总体而言,作者用两种方法特异性改变了内源或外源的mRNA分布,为进一步探究NET1蛋白合成位点相关机制提供了基础

02
差异现象:mRNA 位置定点靶向NET1蛋白

NET1蛋白可定位到细胞核和胞质。因此,作者测试了改变NET1 mRNA位置是否会影响这两个目的地之间蛋白质的整体靶向

首先在活细胞中评估了由外周mRNA(GFP-NET1A / WT UTR)或核周mRNA产生的GFP-NET1A的核细胞质分布,发现核周产生的NET1A在核内分裂到更高程度(图2A和2B)。在所有条件下产生的总蛋白质量是相同的,如上所示(图1B),表明细胞质蛋白的减少是由于细胞核的输入增加,而不是由于细胞质降解增加

进一步了解NET1A合成的位点是否影响其与转运受体的相互作用,作者评估了NET1A与导入蛋白β1 / KPNB1的关联,通过免疫共沉淀(coIP)实验发现,核周产生的GFP-NET1A(ΔGA UTR)与导入蛋白β1的相互作用增加。

图2. NET1 mRNA位置决定NET1-导入蛋白结合和核质分布

03
相互作用:新合成的NET1与导入蛋白相互作用

作者在前面观察到NET1 mRNA位置的作用,于是向进一步探究mRNA翻译是否也参与其中

作者用环己酰亚胺嘌呤霉素短暂处理,阻断翻译后NET1A-importin β20相互作用。发现翻译抑制消除了在核周产生的NET1A与importin β1的相互作用(图3A和3B),提示导入蛋白β1主要与新合成的NET1A相互作用

后续,为确定哪些结构域参与NET1A的胞质保留,作者构建了表达缺失突变体的细胞系(图3C),发现与全长蛋白观察到的相似的外周mRNA定位(图3D)

研究发现Plekstrin同源的PH结构域缺失促进了NET1A-importinβ1的相互作用,并增加了核积累。该现象提示PH结构域似乎与NLS竞争,以确定NET1A靶向的最终位置,最终达到蛋白质在核-细胞质的平衡

图3. NLS和PH结构域竞争性地决定新合成NET1A蛋白的核导入

04
调控蛋白:NET1 mRNA位置确定蛋白质靶向

NET1 mRNA定位过程受到哪些蛋白的调控?

为解决这一问题,作者通过质谱分析寻求GFP-NET1A结合伴侣,发现膜相关支架蛋白 CASK参与其中,还进一步证明CASK-NET1A相互作用需要NET1A的PH结构域(图4A)

随后作者利用siRNA敲低了CASK表达,即使NET1 mRNA是外周的,也导致NET1A-导入蛋白β1相互作用增加,并且模仿了PH结构域缺失或核周mRNA中NET1A表达时看到的效果(图4C)

这些结果提示:膜相关支架蛋白 CASK在其中发挥的主要调节作用。

图4. NET1A-CASK发挥调节作用

05
核心机制:通过 NET1A 编码序列改变平移伸长率
蛋白质翻译是动态过程,上述的CASK与NLS-importin结合拮抗的能力也可能在发生动态变化

作者想到翻译速度是否决定蛋白的结合,为了直接测试这个想法,作者通过改编码密码子减慢或者增加翻译速度,发现无论mRNA位置如何缓慢的翻译都会导致与导入蛋白和核靶向的高度相互作用(图5 F和5G)并减少与CASK的结合(图5H),而提高翻译速率具有相反的效果(图 5F-5H)

因此,这些数据表明NET1 mRNA的位置及其翻译速率协同作用下,可改变NET1蛋白相互作用和靶向区域从而引出本文的核心观点:细胞内新合成多肽的位置及翻译速度最终决定其伴侣蛋白和目标目的地

图5. 翻译伸长率决定伴侣蛋白选择和NET1蛋白靶向区域

06
表型研究:TGF-β影响NET1蛋白功能

已知细胞质NET1A参与RhoA GTP酶的活化并控制细胞粘附和迁移确定NET1功能改变是否影响细胞运动,作者使用稳定表达GFP-Lifeact的细胞,通过长期延时成像进一步跟踪单个细胞并测量平均细胞迁移速度图6C),发现外周NET1 mRNA定位对于有效的细胞运动很重要

使用TGF-β诱导,发现紧密粘附的MCF7细胞群溶解和分散(图6D)。TGF-β还增加NET1 mRNA的外周定位(图6E)

提示NET1 mRNA分布可以被外界生理刺激改变,并负责与RhoA信号传导相关的功能变化。

6. NET1 mRNA 定位影响细胞迁移中的 NET1 功能

03
文章总结

机制示意图

上图生动地为我们总结了文章的机制研究主要结果:

01
主要故事

NET1在细胞核与细胞质中的分布就像天平一样,处在一种此消彼长的动态变化中。

02
创新点

上面图中的天平随着蛋白翻译速率变快,天平也随之向着细胞质NET1分布而倾斜。

03
深入机制

而在细胞内参与NET1分布过程的有诸多协同RNA或者伴侣蛋白(如impα β、CASK等)的同时参与。

本文证明NET1mRNA的定位和翻译速率可以决定NET1与importins蛋白或CASK结合,靶向于细胞核或细胞质,发挥不同的功能

  • 核周mRNA、较慢的翻译速率有利于相互作用;

  • 外周mRNA、更快的翻译速率有利于激活RhoA,促进细胞黏附和迁移。

不同于以往的机制探究,这种空间和时间决定功能的研究,还是让人耳目一新。




研究不足

但目前,该研究也有部分技术的局限性:无法更直接地测量核糖体径流速率(翻译速率);二聚体测序深度相对较低;文章数据目前无法辨别mRNA位置和翻译速率之间的关系等。




课题拓展

但瑕不掩瑜,这篇文章启发我们这种时空机制将是未来研究的一个有趣领域在自己课题中,不妨将这种蛋白质在细胞内的亚定位作为课题延伸的方向:

  • 探索不同的定位(细胞质、细胞核、粗面及光面内质网、线粒体等区域)对功能的影响

  • 进一步还可以深入研究哪种因素(翻译速率、不同蛋白的结合、蛋白质的修饰)可以改变蛋白质的定位,继而导致何种改变(增殖、侵袭、血管生产、EMT等表型)。

这样课题也就逐渐丰满,故事性及创新性愈加,更能夺得顶刊编辑的青睐了。


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