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精氨酸的限制诱导金黄色葡萄球菌产生抗生素耐受

BCML速递 · 公众号 · · 2024-11-02 22:26

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金黄色葡萄球菌（ S. aureus ）是全球范围内引起侵入性感染的主要细菌之一，抗生素治疗金黄色葡萄球菌感染具有较好的效果，但它们常常会因为多种因素，如小菌落变异、持久性细胞和生物膜的形成等，使金黄色葡萄球菌产生耐受性，导致感染治疗失败。基于此，来自范德堡大学的 Jeffrey A. Freiberg, Eric P. Skaar 教授团队采用在固 - 气界面生长的金黄色葡萄球菌生物膜的体外模型来研究生物膜生长过程中的抗生素耐受性。使用半定量蛋白质组学和基于转座子测序的筛选方法确定了精氨酸代谢作为金黄色葡萄球菌抗生素耐受性的关键增强剂的新作用，研究结果有助于开发新的治疗策略，以克服 S. aureus 感染对抗生素的耐受性。

首先，研究者描述了S. aureus中精氨酸代谢的两个主要途径：尿素循环和精氨酸脱羧酶途径。尿素循环涉及将L-瓜氨酸转化为L-精氨酸，而精氨酸脱羧酶途径则涉及精氨酸的分解（图1a）。研究者又进行了蛋白质组学分析，使用无标记定量液相色谱-串联质谱技术，分析了S. aureus生物膜在不同抗生素处理下的蛋白质表达差异。热图显示了特定蛋白质在抗生素处理后的丰度变化，精氨酸合成途径中的ArgG和ArgH蛋白在抗生素处理下丰度降低，表明这些蛋白质可能在抗生素耐受性中起作用（图1b）。研究者进一步将菌落生物膜提取的总基因组DNA用于转座子测序，通过转座子测序分析的方法，构建S. aureus的转座子突变库，评估了在抗生素处理下，特定基因突变对细菌生存的影响，热图显示了特定基因在抗生素处理后的适应性变化。ArgG和ArgH基因的转座子插入突变体在多抗生素处理下显示生存优势，这与蛋白质组学结果相一致，进一步证实了精氨酸代谢在抗生素耐受性中的作用（图1c）。

接着，研究者又显示了金黄色葡萄球菌S. aureus生物膜中精氨酸的重要性，以及精氨酸对细菌生长和存活的影响。在缺乏精氨酸时，JE2菌株无法建立菌落生物膜，这表明精氨酸对于细菌在生物膜形式下的生长至关重要（图2a）。将48小时的成熟菌落生物膜转移到不含精氨酸的CDM培养基（CDM-R）中，生物膜不仅无法生长，而且存活率下降。这进一步证实了精氨酸对于生物膜中细菌存活的必要性（图2b）。通过分析48小时成熟菌落生物膜中的氨基酸，结果在含有精氨酸的培养基中，生物膜中游离精氨酸的水平也无法检测。这表明生物膜内的精氨酸可能是限制细菌生长的因素之一（图2c）。

之后，研究者探索了S. aureus生物膜在不同条件下对多种抗生素的耐受性。图3a显示了在化学定义的培养基中，含有或不含有精氨酸的情况下，将48小时的成熟菌落生物膜转移到新的培养基上，并添加或不添加抗生素的实验设计过程。图3b显示了在相同条件下，将菌落生物膜均质化后转移到液体培养基中的实验设计，以测试抗生素对均质化生物膜细菌的影响。研究者进一步证明在含有和不含有精氨酸的培养基中，添加不同抗生素（万古霉素、头孢他林、德拉氟沙星和利奈唑胺）培养后，生物膜细菌的存活情况具有较大差别。结果显示，与完整的生物膜相比，机械破坏的生物膜对抗生素的整体敏感性更高，特别是在破坏的生物膜中，精氨酸的存在或缺失对抗生素的杀菌效果有显著影响。精氨酸的缺失导致在万古霉素、头孢他啶和德拉沙星培养条件下的抗生素耐受性显著增加。在48小时的抗生素暴露后，这三种抗生素在有无精氨酸的培养基中，菌落数量差异超过100倍。因此，精氨酸对抗生素敏感性的影响可能与金黄色葡萄球菌在生物膜生长期间的代谢活动有关，而与生物膜的结构无关（图3c-h）。

研究者又进一步证实了S. aureus的抗生素耐受性是由氨基酸饥饿介导的，并导致蛋白质合成停止。研究者通过点击化学的方法标记新生蛋白质并通过Western blot实验进行可视化和定量分析，结果证实了在缺少精氨酸的情况下，蛋白质合成受到了显著抑制（图4a-b）。研究者进一步测试了耗尽金黄色葡萄球菌已知的其他必需氨基酸是否会引起抗生素耐受性。与没有精氨酸的培养基中观察到的情况类似，去除缬氨酸或脯氨酸后金黄色葡萄球菌生物膜对万古霉素、头孢他啶和德拉沙星的耐受性增加，相比之下，去除非必需氨基酸丙氨酸对抗生素耐受性没有影响（图4c）。研究者又测试了多种蛋白质合成抑制剂诱导抗生素耐受性的能力。在CDM琼脂上培养48小时的生物膜被转移到液体培养基中，这些培养基中加入蛋白质合成抑制剂。添加这些蛋白质合成抑制剂导致对头孢他啶的耐受性增加（见图4d）。通过有无精氨酸的情况下添加万古霉素的生物膜培养实验结果表明当精氨酸受到限制时，在万古霉素存在的情况下也会出现蛋白质合成的停滞，而精氨酸存在时，即使添加了万古霉素，蛋白质合成也在继续（图4e），图4f表明relA基因突变株（relA::Tn）中，精氨酸的缺乏并不影响万古霉素的耐受性。这表明饥饿反应可能介导了精氨酸缺乏引起的抗生素耐受性。

最后，研究者探索了S. aureus在不同条件下对抗生素的敏感性，以及精氨酸和瓜氨酸对抗生素敏感性的影响。图5a展示了在培养基中，缺乏精氨酸时，添加瓜氨酸可以恢复金黄色葡萄球菌生物膜对抗生素的敏感性。这表明瓜氨酸可能通过转化为精氨酸来逆转精氨酸限制引起的抗生素耐受性。在精氨酸合成途径中的argH基因突变株（argH::Tn）中，添加瓜氨酸并不能恢复其对抗生素的敏感性。这表明argH基因在精氨酸的合成和抗生素敏感性中起着关键作用（图5b）。在argH基因突变株中，通过互补表达argGH操纵子（argH::Tn + attC::Plgt-argGH），可以在添加瓜氨酸的情况下恢复其对抗生素的敏感性，结果显示通过补充精氨酸合成途径，可以逆转抗生素耐受性（图5c）。研究者进一步通过小鼠皮肤感染模型证实在抗生素治疗下，argH基因突变株在体内具有更高的生存能力（图5d）。

综上，本文通过研究S.aureus在生物膜状态下对抗生素的耐受性，发现精氨酸代谢在调节这种耐受性中起着关键作用。通过定量蛋白质组学和转座子测序筛选表明精氨酸的限制可以诱导细菌对多种抗生素的耐受性，这一效应与抑制蛋白质合成有关。在小鼠感染模型中，精氨酸合成途径的突变株在抗生素治疗下显示出更高的生存能力，强调了精氨酸代谢与抗生素耐受性之间的关系。这些发现为开发针对难治性金黄色葡萄球菌感染的新疗法提供了潜在的靶点。

本研究由范德堡大学的Jeffrey A. Freiberg 和 Eric P. Skaar教授团队完成，于2024年7月31日发表于Nature Communication。

论文信息：Jeffrey A. Freiberg ^* , Valeria M. Reyes Ruiz, Brittney D. Gimza , Caitlin C. Murdoch, Erin R. Green, Jacob M. Curry, James E. Cassat, Eric P. Skaar ^* . Restriction of arginine induces antibiotic tolerance in Staphylococcus aureus. Nat Commun 2024,15: 6734.

供稿：陈伟成

审校：陈嵩

编辑：季威