近日，合肥工业大学殷俊教授课题组于2024年7月11日和10月8日分别以Functionalized Hydroxyapatite and Curcumin Incorporated Stimuli-Responsive Low-Exothermic and Injectable Poly(methyl methacrylate) Bone Cement for the Treatment of Osteomyelitis和Polymorphic Supramolecular Therapeutic Platforms with Precise Dye/Drug Ratio to Perform Synergistic Chemo‐Photo Anti‐Tumor Therapy and Long‐Term Immune Protection为题在Advanced Functional Materials和Advanced Healthcare Materials上发表了两篇研究论文。分别介绍如下：
随着人口老龄化时代的到来，骨疾病日益增多，骨替代生物材料已成为骨再生治疗策略中迫切需要并被广泛认可的有效方法。然而，不合适的机械性能、不可控的固化时间以及高放热性在一定程度上影响了其临床应用。基于上述问题，合肥工业大学殷俊教授课题组构建了一种由聚甲基丙烯酸甲酯、羟基磷灰石、姜黄素、氧化海藻酸钠和聚乙烯亚胺组成的刺激响应型低放热可注射式骨水泥（图1）。利用酸和H2O2响应性共价键的优点，赋予该骨水泥具有优异的压缩强度(>70 MPa)、弯曲强度(>50 MPa)、适宜的固化时间(9-14分钟)和低放热(<42 oC)，同时能在骨髓炎微环境触发下释放内含药物。在细胞水平和大鼠骨髓炎模型中均证实该骨水泥具有优异的生物相容性（细胞存活率：>97%；溶血比率：<1.8%）、抗菌性（最低细菌存活率：≈1.7%）、抗炎性（iNOS、CD86、TNF-α、IL-1β和IL-6的表达显著受到抑制）以及促进骨再生的能力。该工作为骨组织工程提供了一种具有生物活性的有机/无机复合材料，其独特的低放热特性和前药技术集成的多功能优势赋予其潜在的临床应用前景。该工作以题目为“Functionalized Hydroxyapatite and Curcumin Incorporated Stimuli-Responsive Low-Exothermic and Injectable Poly(methyl methacrylate) Bone Cement for the Treatment of Osteomyelitis”发表于《Advanced Functional Materials》上（Adv. Funct. Mater. 2024, 34, 2406817.）。如图1所示，新鲜混合的骨水泥浆料能够轻易从注射器中挤出并保持连续状态，证实了其优秀的注射性和成型性，适合用作复杂的骨空间的填充材料。FT-IR光谱表明HA成功掺入PMMA基质中，XPS分析进一步确认了HA、OSA和PEI的存在，EDS（能量色散光谱）映射显示Ca、P和C元素在PMMA中均匀分布，证实了固相和液相的成功混合。
图1. 基于PMMA的骨水泥的注射性能以及结构表征骨水泥固化时间是填充材料的关键参数，会影响治疗过程中的实际操作时间。如图2所示，随着PMMA含量的降低，所有样品的固化时间延长（从9到14分钟不等），且PMMA含量和比例对固化时间有明显的依赖性。骨水泥在固化过程中释放热量对周围骨组织有重要的影响，在固化过程中，虽然PMMA骨水泥的放热温度逐渐上升，但最高温度远低于纯PMMA，且低于ISO-5833标准规定的90 ℃，表明新型骨水泥具有较低的放热，有利于保护周围组织。此外，压缩强度、弹性模量和弯曲强度随着PMMA含量的减少而降低，但仍满足ISO 5833标准要求的最低值。这表明通过调整PMMA含量和比例，可以在保持所需机械性能的同时，改善骨水泥的生物相容性和操作性能。
图2.骨水泥固化时间、固化放热温度监测以及机械强度表征巨噬细胞在免疫系统的调节中发挥重要作用，其中M1型巨噬细胞通过促进促炎细胞因子的释放加重炎症，并成为氮种（RNS）的重要来源，导致组织损伤。该研究评估了PMMA基骨水泥对诱导性一氧化氮合酶（iNOS）表达的抑制作用。实验结果显示（图3），LPS与纯PMMA组的iNOS荧光强度最高，而与PMMA结合的组（LPS&C0.4H0.8@P0.86和LPS&C0.3H0.77@P0.86）的荧光强度显著下降，表明姜黄素能够有效抑制iNOS的产生，从而保护组织。此外，RT-qPCR结果表明PMMA骨水泥显著降低了多种促炎因子的mRNA表达，尤其是LPS&C0.4H0.8@P0.86组。西方印记(Western blot)分析进一步确认了iNOS和CD86的蛋白表达显著减少。
该研究探讨了PMMA骨水泥对骨髓间充质干细胞（BMSC）骨生成和骨分化的影响（图4）。通过碱性磷酸酶(ALP)染色和定量检测，观察到C0.4H0.8@P0.86和C0.3H0.77@P0.86组显示出更明显的成骨细胞增殖。ARS染色也表明这些组具有更好的生物矿化能力。通过Western blot技术检测成骨标志物Runx2和Col-1的蛋白表达水平，发现PMMA骨水泥显著提高了这些蛋白的表达量，证实了其促进骨形成的巨大潜力。另一方面，通过酸性磷酸酶(TRAP)染色检测了PMMA骨水泥对破骨细胞增殖的抑制作用，发现PMMA骨水泥能显著减少TRAP阳性破骨细胞的数量，并且随着PMMA骨水泥中姜黄素含量的增加，抑制效果更为明显。此外，通过qRT-PCR分析了破骨细胞相关因子的表达水平，包括Ctsk、c-Fos和NFATc1，[email protected]组显示出最大的抑制比例。这些结果表明PMMA骨水泥不仅促进了成骨细胞的分化和矿化，还有效抑制了破骨细胞的生成，从而在骨组织修复和再生方面展现出了积极的潜力。基于以上细胞级别的优越表现，C0.4H0.8@P0.86和C0.3H0.77@P0.86两组被选用于后续动物模型实验。
在体内效果评价中，该研究建立了小鼠胫骨骨髓炎模型，并设置了空白对照组（仅注射MRSA）和纯PMMA组。如图5所示，经过两个月的治疗，C0.4H0.8@P0.86和C0.3H0.77@P0.86组显示出显著的骨修复效果，且骨矿物质密度（BMD）、新骨体积与组织体积比（BV/TV%）和小梁厚度（Tb.Th）分别是对照组的1.44倍、2.92倍和2.25倍，且小梁间隔（Tb.Sp）减少约54.9%。与对照组相比，PMMA骨水泥的治疗效果明显优于对照和纯PMMA组，显示出在骨组织替代工程中的应用前景。
该论文第一作者为中国科学技术大学附属第一医院（安徽省立医院）主任医师尤涛博士，该项研究得到了国家自然科学基金、合肥综合国家科学中心前沿医学与技术研究院项目以及安徽省高校自然科学研究项目的支持。恶性肿瘤已成为威胁世界各国人民生命健康的可怕疾病之一，其诊断和治疗是人们密切关注的问题。然而，最佳治疗剂量、不良反应和长期免疫激活是肿瘤治疗的关键和瓶颈问题。基于上述问题，合肥工业大学殷俊教授课题组通过IR780-CPT2共轭物与β-CD和PEG组成的亲水共聚物之间的主客体络合作用，构建了具有精确的染料与药物比例（1:2）的不同形貌（囊泡、球、棒）的超分子治疗平台。该超分子平台具有近红外光和还原性刺激响应特性，且在体外细胞实验和体内小鼠模型中均具有良好的肿瘤细胞杀伤效果，其中棒状纳米粒子因其高效的细胞摄入表现出最优的治疗效果。更重要的是，在保证生物安全性的同时，化疗-光疗协同治疗成功诱导了高迁移率族蛋白B1（HMGB1）和钙网蛋白（CRT）的上调，刺激了树突状细胞的成熟（mDCs）、增强了T细胞的浸润以及肿瘤坏死因子α（TNF-α）和γ-干扰素（INF-γ）的表达，证明了机体的免疫效应被成功激活。因此，在原发肿瘤治疗过程中，远端肿瘤也受到抑制。该研究为制备不同形貌的超分子治疗平台，提高抗肿瘤和抗转移能力提供了一条独特的途径。该工作以题目为“Polymorphic Supramolecular Therapeutic Platforms with Precise Dye/Drug Ratio to Perform Synergistic Chemo‐Photo Anti‐Tumor Therapy and Long‐Term Immune Protection”发表于《Advanced Healthcare Materials》上（Adv. Healthcare Mater. 2024, 2402907）。为构建超分子治疗诊断平台，通过共溶剂法将C1和P1共同组装，如图6所示，当P1和C1浓度分别为0.1和0.08 µM时，观察到均匀的单分散囊泡（A1，230 nm）。随着C1浓度增至0.12 µM，形成了球形纳米颗粒（A2，190 nm），这种形态变化归因于IR780的增强堆叠和β-CD-CPT复合物交联的增加。在C1浓度达到0.16 µM时，小球形纳米颗粒融合成了棒状纳米颗粒（A3，260 nm），可能是由于疏水性增加所致。进一步提高C1浓度至0.2和0.3 µM时，形成了直径分别为990 nm和2030 nm的大球形纳米颗粒（A4和A5），这可能是由于广泛的氢键作用和π–π堆叠造成的。
选取了三种符合EPR效应的纳米载体A1、A2和A3，探讨了其在体外细胞实验中的疗效（图7）。通过MTT实验发现在无近红外光（NIR）照射的情况下，A1、A2和A3的细胞活性随着浓度增加而下降；而应用NIR照射后，细胞活性显著降低，表明NIR光的光热转换效果显著增强了化疗的疗效，其中A3的效果最佳。此外，通过激光共聚焦显微镜跟踪纳米粒子的内吞作用，发现A3的内吞速率较A2和A1快，归因于A3的小窝介导的内吞方式避免了溶酶体的捕获和分解。此外在808 nm近红外光照射下，组装体均可产生大量的活性氧。
图7. 体外细胞活性、活性氧生成能力和胞吞速率评价为进一步评价抗肿瘤性能，构建4T1小鼠模型评估纳米组装体的体内抗肿瘤效果。如图8所示，在不使用激光的情况下，与PBS组相比，A1-A3组在肿瘤生长率上显示出一定的抑制作用，但未能完全抑制肿瘤的增长。然而使用808 nm的近红外光照射后，三组的肿瘤明显缩小，A3组在14天后几乎完全消失。对肿瘤体积、肿瘤重量和小鼠体重的监测显示，治疗后肿瘤得到有效抑制且体重维持良好，体现出较高的生物安全性和无复发能力。组织切片显示，A1-A3组肿瘤组织出现核损失、细胞收缩和凝固，并且Ki67染色结果表明，A3组在NIR光照射下几乎没有Ki67阳性表达，进一步证实了协同治疗在肿瘤管理中的优越效果。
光热疗法（PTT）和光动力疗法（PDT）可以诱导免疫原性细胞死亡（ICD）以及与之相关的损伤相关分子模式（DAMPs）的释放，进而促进免疫细胞的浸润。介此，该研究评估了纳米组装体（A1-A3）对肿瘤免疫微环境的调节作用。如图9所示，A3组在NIR光照射下促进了树突状细胞（DCs）的成熟和T细胞（CD45、CD3+、CD4+、CD8+）的招募，且相应的免疫抑制细胞（Treg）的比例显著降低，增强了免疫活性。同时，在NIR光照射组中，关键的促炎细胞因子IFN-γ和TNF-α的水平也显著高于非照射组，验证了光疗的强大免疫激活效果。A3组在肿瘤细胞杀伤、细胞内单态氧生成、免疫因子和细胞表达方面表现最优，并展示了最小的肿瘤质量和体积。这种优越的抗肿瘤效果与A3的高疏水性和独特的棒状形态有关，促进了细胞膜的粘附和内吞作用。总体而言，A3组在光照下的实验结果显示出将冷肿瘤转变为热肿瘤的潜力，为临床免疫激活的挑战提供了新思路，促进了个性化治疗方案的设计和临床转化。
此外，该研究通过建立双侧肿瘤小鼠模型来研究不同治疗方案对远端肿瘤的影响。如图10所示，无论是否应用NIR激光，PBS组的远端肿瘤体积均逐渐增大，而A1-A3组在未使用激光的情况下肿瘤明显小于PBS组；使用NIR激光后，A1-A3组的老鼠未见肿瘤。免疫监测结果表明，A1-A3组的小鼠淋巴结和脾脏中的CD4+和CD8+T细胞比例显著高于PBS组，并在激光照射后进一步增加。这些结果确认了联合治疗能够有效激活免疫系统，并表明此类治疗具有系统性的免疫应答，能够为机体提供安全的保护屏障。
该文章通讯作者为合肥工业大学化学与化工学院殷俊教授、安徽医科大学药学院王学富教授以及安徽医科大学第一附属医院副主任医师陶龙香博士，第一作者为合肥工业大学博士研究生闫金浩，安徽医科大学硕士研究生王浩其、博士研究生赵雪沁为论文共同第一作者。该项研究得到了国家自然科学基金、安徽省高校优秀青年学者科学基金以及安徽省高等教育科学研究项目的支持。
原文链接：
1. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/adfm.202406817
2. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202402907
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