J. Am. Chem. Soc. | 负责脂质纳米颗粒识别和结合的细胞受体的研究

大家好， 今天为大家介绍的是最近在 J ournal of the A merican C hemical S ociety 上报道的一篇标题为 “ Identification of Cell Receptors Responsible for Recognition and Binding of Lipid Nanoparticles ” 的文章。该文的通讯作者 是 国家纳米科学技术中心的王黎明教授和陈春英教授。 本研究提出了一种新型 “ Fishing ”策略，结合生物传感器和实时分析技术，原位研究 LNPs 的蛋白冠动态形成及其与细胞受体的相互作用，旨在揭示抗 PEG 抗体和补体成分如何调控 LNPs 的吞噬机制，为优化 LNPs 设计提供理论支持。

脂质纳米颗粒（ LNPs ）是 mRNA 疫苗（如 COVID-19 疫苗）的关键递送载体，但其在人体中可能引发系统性细胞因子反应（如发热、寒战）和剂量依赖性副作用，而在小鼠模型中未观察到类似现象。这种差异可能与人类特有的血浆蛋白冠形成有关。血液中的生物分子是如何调节蛋白质冠的组成，以及随后调节纳米材料的命运的，目前尚不完全清楚。但在研究过程中同样需要考虑人类血液中蛋白质组成的个体差异以及人和动物模型之间的差异。

在 L NP s 的体内应用过程中，已经检测到高水平的聚乙二醇（ PEG ）循环抗体，它们识别 L NP s 并激活补体系统，导致 L NP s 的快速清除。人们希望能够高效传递 LNP s ，但人类细胞识别 LNPs 的机制，特别是细胞表面的吞噬受体和内吞体逃逸的途径尚不清楚。因此，弄清蛋白质和细胞受体对聚乙二醇化 LNPs 的识别过程对于揭示抗 PEG 抗体对体内 LNPs 作用及其对靶向器官或细胞的影响至关重要。

表征 LNPs 周围的蛋白质冠对于理解它们在生物系统中的行为至关重要。然而，由于 LNPs 与血浆和血清中的天然脂质、脂蛋白或细胞外囊泡在大小和密度上的相似性，这仍然具有挑战性。传统分离技术（如超速离心、尺寸排阻色谱）因 LNPs 与天然脂蛋白 / 细胞外囊泡的相似性而受限，且可能破坏蛋白冠结构。因此，本文开发了“ Fishing ”方法，这是一种快速的、基于亲和性的实时蛋白冠隔离技术。结合蛋白质组学分析，这种方法能够精确鉴定蛋白冠组成和相互作的细胞受体，。

具体而言， “ Fishing ”方法包括以下目标： (1) 使用原位技术来分析 LNP s - 蛋白相互作用和识别 LNP s 蛋白冠的细胞受体； (2) 研究人血浆中蛋白冠形成的动力学； (3) 探索血浆生物分子水平的变化，如抗体，如何影响蛋白冠的形成和 LNPs 的命运。将 L NP s 通过碳二亚胺交联在探针表面，将传感器与接种后个体的血浆共同孵育，形成血浆蛋白冠或膜蛋白冠，再用不同的洗涤缓冲液分离形成的蛋白冠并进行组学分析。（图 1 ）

图 1. 识别 LNPs 相关蛋白冠及其与细胞膜蛋白相互作用的“ Fishing ”方法示意图

首先，作者团队使用 “ Fishing ”和传统离心法分别分离 LNPs 的蛋白冠，通过质谱比较蛋白组成。结果表明，离心法导致补体成分（如 C3 、 C4a ）减少，而免疫球蛋白（ IgM ）增加，硬冠（与 L NP s 稳定结合层）中 IgG 减少 3.6 倍，提示离心过程可能破坏蛋白相互作用。“ Fishing ”法更接近天然状态，硬冠中免疫球蛋白（ IgG/IgM ）和补体成分占比高，软冠（更外层的动态交换部分）则以白蛋白为主。与离心不同，“ Fishing ”方法不会改变血浆成分或损害 LNPs 的完整性，确保了更准确地表示自然蛋白冠的形成过程。（图 2 ）

图 2. 通过 “ Fishing ”法与离心法鉴定的 LNPs 蛋白冠组成的区别

随后，作者团队进一步分析了硬冠和软冠的蛋白聚类及相互作用网络，并研究抗 PEG 抗体（ IgG/IgM ）与 LNPs 的结合亲和力。抗 PEG IgG 对 LNPs 具有高亲和力，而普通 IgG 无直接结合。抗 PEG IgM 亲和力较低，且与补体 C3 无直接相互作用。表明补体 C3 与 IgG 在硬冠中协同作用，驱动蛋白冠的动态重构。（图 3 ）

图 3. L NP s 周围蛋白冠成分的动力学分析

接下来，作者使用 “ Fishing ”法筛选与 LNPs- 血浆蛋白冠结合的细胞膜受体。通过加入人髓系白血病单核细胞（ THP-1 ）和早幼粒细胞（ HL-60 ）的膜蛋白溶液，形成膜蛋白冠。经过蛋白质组学分析，鉴定出粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子受体 β （ CSF2RB ）为 LNPs 吞噬的主要受体，在硬冠中占比 18% 。表面等离子共振（ SPR ）显示抗 PEG IgG 与 CSF2RB 直接结合，而补体 C3 需依赖 IgG 作为桥梁。说明血浆蛋白冠中的补体和免疫球蛋白通过协同作用激活 CSF2RB 介导的吞噬。。（图 4 ）

图 4. 识别 LNP- 血浆蛋白复合物的细胞受体鉴定

接下来，作者团队通过 SPR 和竞争实验详细研究了抗 PEG IgG/IgM 与 CSF2RB 的结合模式。结果表明高浓度抗 PEG IgG 覆盖 LNP 表面，促进补体 C3 调理结合和 CSF2RB 识别。而高浓度的 IgM 可替代 IgG ，抑制 C3 调理作用，从而降低吞噬效率 。因此，蛋白冠中 IgG/IgM 的比例可以动态调控 LNPs 的吞噬途径和受体识别能力。（图 5 ）

图 5. 使用 SPR 测定血浆蛋白冠与 CSF2RB 有相互作用的主要成分以及动力学

最后，作者团队进行了 CSF2RB 在 LNPs 吞噬中的功能验证。通过 siRNA 敲低 CSF2RB ，检测 LNPs 在髓系细胞（中性粒细胞、单核细胞）中的摄取效率。敲低 C SF2RB 后，中性粒细胞和单核细胞的 LNPs 摄取分别减少 2.3 倍和 2.1 倍。且抗 PEG 抗体处理导致 CSF2RB 表达下调，证明可能存在受体内吞降解的过程。表面抗 PEG IgG 通过补体 C3 调理增强 CSF2RB 介导的内吞，而 IgM 无此效应。（图 6 ）

图 6. 基因水平验证人髓系细胞通过 CSF2RB 受体吞噬 LNPs

图 7. 人血液中 LNPs 的行为受到血浆冠状成分的调节，这些成分最终通过受体介导的途径影响髓系细胞对 LNPs 的摄取

综上所述，作者团队基于上述实验证据提出了 LNPs 体内行为的调控模型。进入血液后，抗 PEG 抗体（ IgG/IgM ）和补体成分（ C3 ）共同形成 LNP 表面生物识别层。随后， CSF2RB 通过识别 IgG-C3 复合物触发髓系细胞的吞噬作用。（图 7 ）调控蛋白冠组成可优化 LNPs 的靶向性和安全性。本研究通过创新的“ Fishing ”方法，揭示了抗 PEG 抗体和补体成分在 LNPs 蛋白冠形成中的核心作用，并鉴定出 CSF2RB 为髓系细胞吞噬 LNPs 的关键受体。这一发现为设计更安全、高效的 LNP 递送系统提供了分子机制支持，并为个性化纳米医学奠定了基础。

作者： DYH 审校 ： SYM

DOI: 10.1021/jacs.4c16987

Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.4c16987

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