摘要：冷冻干燥技术是生物制剂的主要生产工艺，采用冷冻干燥工艺可保持产品原有的理化性质和生物活性，且有效成分损失极少。干燥后的产品形状、体积、晶型等理化指标均一性好。产品因含水量低而易于长期保存, 因疏松多孔而使得加水后可迅速完全溶解。但在冻干制剂的生产或实验中我们总会有一些冻干上的问题，下文就是我们在冻干制剂上的主要问题的分析。
关键词：制剂 预冻 共晶温度 玻璃态转化 崩解温度 干燥 稳定性 水分 保护剂
一 冷冻干燥技术
1 冷冻干燥技术的发展
随着真空泵和制冷机的出现，冷冻和干燥理念的结合，近些年来冷冻干燥技术在全世界发展迅速，应用非常广泛。冷冻干燥技术的发展史已经百年有余，从最初发现冷冻干燥技术，以及真空条件下水的饱和蒸汽压于水的温度关系，到采用主动加热方法减短干燥时间并用于生产化。1958年的第一届冷冻干燥会议促进了冻干的发展，在食品、药品、建材等行业得到广泛应用。近些年来，伴随着电子计算机和传感测量技术在冻干领域的应用，冻干技术已加入高新技术领域行列。人体器官的保存和再植的研究，营养保健食品的追求，超轻隔热陶瓷在航天飞机的应用，以及低温超导材料等纳米级超细微粉材料的制备，都需要真空冷冻干燥技术和设备。在医药领域中，真空冷冻干燥技术对药品和医疗事业都有重要应用。药品方面上包括生物制品（活菌菌苗、活毒疫苗、一些生物制品和生化药品等）、化药生产（多位注射剂：抗生素药、循环器官用药、中枢神经用药、维生素类和肿瘤用药等）、中药生产（中草药、中成药）；医疗事业上对保存血液、动脉、骨骼、皮肤、角膜和神经组织等各种器官上效果良好。
2 冷冻干燥的定义及优缺点简述
冷冻干燥是指将被干燥含水物料冷冻成固体，在低温减压条件下利用水的升华性能，使物料低温脱水而达到干燥目的的一种干燥方法。是将热能通过与物料接触的壁面以传导方式传给物料，使物料中的湿分气化并由周围空气气流带走而干燥的操作。冷冻干燥过程物质本身剩留在冻结时的冰架中，因此它干燥后体积不变，疏松多孔在升华时要吸收热量。升华吸收热量会引起产品本身温度的下降而减慢升华速度，为了增加升华速度，缩短干燥时间，必须要对产品进行适当加热，整个干燥是在较低的温度下进行的。冻干有很多优点，低温低压下许多热敏性的物质像蛋白质、微生物之类不会发生变性或失活，微生物的生长和酶的作用无法进行，可保持原来的性状，真空下氧气极少，易氧化的物质得到了保护。干燥能排除95-99%以上的水分，使干燥后产品能长期保存而不致变质。在低温下干燥时，物质中的一些挥发性成分损失很小，干燥后的物质呈海绵状疏松多孔，加水后速溶完全，几乎立即性状复原。冻结状态进行干燥可使体积几乎不变，结构不变，不浓缩，原本的溶解物质在物料中分配均匀且升华不析出，防止表面硬化。冻干过程污染机会少，易实现无菌操作。冻干有几点缺点：溶剂不能随意的选择，特殊晶型制备很困难，一些产品复溶会混浊，冻干时间长成本高。
3 冷冻干燥的原理介绍
水分在物料中存在有两种方式，一种是游离水（自由水），冷冻干燥中的主要对象，自由水与物料主要以吸附和渗透的形式结合，大量存在与物料的表面、毛细管、孔隙中，冻干时稍低于0℃就结冰，以升华的方式被除去。另一种是结合水，以化学结合水形式存在于物料的组织中，结合力强，在-50℃到-60℃条件下才能冻结，一半在冻干后期，随温度的增加以蒸发的形式被除去。升华过程可用水的三相图图1来说明，水在不同的温度和压力下，以气态、液态或固态存在。在相图上，三相点O点以上，可能以固、液、汽三态之一的状态存在，而在三相点以下，只有固汽两相。水的三相点参数为温度0．01℃ ，压力610 Pa。在610 Pa以下给冰加热，就可直接升华为水蒸汽。 纯水可在0℃固化结晶，各种物料中的液体却是含有不同溶质的水溶液，其冻结温度各不相同，物料中水溶液完全冻结的温度为其共晶温度。不同物质或同一物质含水量不同时其共晶温度也各有不同，需经实验得出。
图1水的三相图及产品冻干后结构图
二 预冻条件的优化
预冻过程在很大程度上决定了干燥过程的快慢和冻干产品的质量，产品预冻的效果由三个参数确定:预冻最低温度、预冻速率和预冻时间。预冻条件的优化需要我们做到针对自己使用的冻干机性能和三个参数优化中找到适合的条件。
1 预冻最低温度的确定
目前，在预冻温度的确定上很多生产厂家和实验部门没有给予足够重视，随着冻干生产量的不断扩大，盲目的深度预冻将造成能源的浪费和升华干燥时间的消耗。预冻温度和共晶温度密切相关，我们熟知纯水可在0℃固化结晶，但各种物料中的液体却是含有不同溶质的水溶液，其冻结温度各不相同，物料中水溶液完全冻结的温度为其共晶温度（Te，共熔点）。不同物质或者同一物质含水量不同时其Te各有不同。纯水没有带电离子是不导电的，含有物料的溶液中有带电离子，当物料中水分被冻结，带电离子也会被固定住，导电能力急剧下降，物料的电阻也急剧增加。根据此原理，利用Te的测定设备测定物料降温冻结过程中与冻结后的物料升温融化过程中电阻值的变化最剧烈时对应的温度就是物料的Te。此设备包括万用表、铜电极、物料池、热电阻、温度显示仪五个部件，如今市场上已有代测共晶温度或出售测量设备的卖家。一般预冻结温度比Te低8℃～10℃就可以，保险起见可以比Te低15℃就应该没问题。多数产品的Te在-15℃～-25℃之间，若没有条件知道产品Te，一般预冻最低温度定在-40℃～-35℃比较合适。对于瓶装产品，小瓶在温度剧变时可能会发生掉底现象，我们曾做过一组预冻试验, 在其它条件完全相同的前提下, 倒锅底形“˄”凹底小瓶几乎无掉底现象, 圆弧“∩”凹底小瓶掉底现象明显增多, 而平底“-”小瓶则掉底严重。所以选瓶时应试验瓶底对冷冻温度的耐受程度, 选择最适宜的温度, 以免造成损失。
2 选择适宜的预冻速率
冷冻时形成的冰晶大小会影响干燥速率和干燥后产品的溶解速度，我们必须要根据产品的不同经试验得出一个最佳的冷冻速率。通常介绍冻干理论的书籍都会提到，降温速率越大，溶液的过冷度和过饱和度愈大，临界结晶的粒度则愈小，成核速度越快，容易形成颗粒较多尺寸较小的细冰晶。因而冰晶升华后，物料内形成的孔隙尺寸较小，干燥速率低，但干后复水性好，这就是快冻；相反，慢速冻结容易形成大颗粒的冰晶,冰晶升华后形成的水气逸出通道尺寸较大，有利于提高干燥速率，但冻干后复水性差。有人曾经质疑过这条理论是在受热均匀的前提下得出来的，比较理想，而生产中和实验中的冻干机所提到的冻干条件没有那么理想，在丁香园论坛上看到一位叫tinybayonet的说法，他把快冻慢冻分为以下几类：1）、板温降得较快，且板温比产品温度低很多，则制品底部先冻结产生结晶，但上部液体仍较热，所以不至于瞬间全部结晶，结晶会缓慢生长，就得到了慢冻的效果。2）、板温降得较慢，板温与品温相差不大，则制品整体均匀降温，并形成过冷，当能量积累足够时，瞬间全部结晶，得到了快冻的效果。3）、板温降得很慢，并在低于共熔点的适宜温度保持（或缓慢降温），则制品形成较小的过冷度，液体中先出现少量结晶，继续降温结晶生长，得到大结晶，这即是真正的慢冻。4）、制品浸入超低温环境（如液氮），整体瞬间结晶，形成极细小的晶体（或处于无定形态），这即是真正的快冻。我比较赞同他的观点，企业在大多数情况下采用瓶冻的冻干方法的，瓶冻的受热不均匀现象很明显。
样品进入冻干箱前的温度越高，样料液上下部分的温度梯度越大，冰晶生长速度越慢。溶液若慢速降温，则形成冰晶比较粗大，冰界面由下向上推进的速度慢，溶液中溶质迁移时间充足，溶液表面冻结层溶质积聚也就多。因而导致上表层的溶质往往较多，密度较高，而下底层密度较小，结构疏松。同时，在不同的预冻温度下冻结的样品，干燥后支架孔径大小有明显差异。预冻温度愈低，支架孔隙直径愈小。这种分层现象又叫溶质效应，在骨架差的制品上体现得最为明显，或者底部萎缩，或者中间断层，或者顶部突起，或者顶部脱落一层硬壳，不一而足。溶质效应是由于水的冻结使间隙液体逐渐浓缩，从而使电解质浓度增加，引起蛋白质的变性和细胞脱水，导致细胞死亡。溶质效应在水的冰点和共晶点之间这一温度范围最为明显。若能以较高的冷冻速度越过这一范围,则可大大削弱溶质效应。在实践中，也有人提倡使用三步法，即将样品从室温先冷却至样品的初始冻结温度；停止降温过程，使样品内温度自动平衡，消除其内的温度梯度；然后再迅速降温，由于此时样品整体温度离结晶温度较近，且样品在冻结过程中，样品温度下降较慢，故样品在冻结过程中温度梯度会相对较小，冰晶生长速度必相对较快。如此，便提高了预冻速率，解决了溶质聚集在上层的问题。不过，并不是所有的品种使用了三步法后都能取得明显效果的。
3 预冻时间该如何确定
适宜的预冻时间可确保抽真空之前所有的产品均已冻实，以不致因抽真空而喷瓶为前提。由于物体的传热为先表层后内部，冻干箱内的产品不可避免地存在一定的温度梯度, 这就需要依靠相应的保温时间和改善传热效率来缩小温度差异。将盘装冻干改成抽底盘冻干，让玻璃瓶直接与板层接触，不失为改善传热的好办法。多次试验表明，采用抽底冻干，产品温度下降明显增快，在样品达到预冻最低温度后，保温1～1.5小时即可。目前实验室冻干机可以采用抽底冻干方法，但生产用的大型冻干机大多数还没有采用这种方法，保温时间要在2～4h。
三 干燥阶段
1 干燥阶段条件
升华干燥的时间长短与产品的品种及分装的厚度以及升华时提供的热量有关，在产品品种及分装厚度已定的情况下，若要缩短时间，保证质量，就必须从加速热量传递着手。冻干箱的板层是产品获得热量的来源，而箱体内的压强则是产品获得热量的环境条件。长期以来, 由于国产冻干机的性能较差，各企业间又缺少相互交流，总以为冻干箱内的压强越低越好，其实并非如此。压强低当然有利于产品内冰的升华，但若压强过低，则对传热不利，产品不易获得热量，升华速率反而降低。而当压强过高时，产品内冰的升华速度减慢，产品吸收热量将减少，于是产品自身的温度上升，当高于共溶点温度时，产品将发生溶化造成冻干失败。那么什么样的压强较合适呢，经验证明，冻干箱的压强在10 ～30Pa 时，既有利于热量的传递，又利于升华的进行。而要将压强严格控制在这个范围之内，没有好的冻干设备是不行的。目前国产冻干机多数没有此控制装置，加上控制检测仪表的灵敏度较差，使升华速度受到很大影响，所以若使用国产冻干设备，必须将各主要部件进行适当地调整改进，并增加真空控制装置，这样将大大缩短升华时间。
在解吸阶段，产品内冻结冰已不存在，因而可以将产品温度迅速上升到设定的最高温度，这样既有利于降低产品的残余水份，也可以缩短解吸干燥时间。从理论上讲，一旦产品内冻结冰升华完毕，产品的干燥便进入了解吸阶段，而在实际操作中，如何界定产品的两个干燥过程, 则很难把握。另外，在什么时候迅速提高产品温度, 对玻瓶的影响最小，也应加以考虑。经过多次试验探讨之后, 我们基本可以认定，正常情况下，产品在到达0℃时已进入了解吸干燥阶段；而在0℃以上时即使温度迅速上升，对玻瓶的影响也相对较小。
为了确保冻干产品质量，在冻干全过程运行即将结束前进行压力升高试验是很有必要的。具体方法是：关闭冻干箱和冷凝器之间的阀门，注意观察冻干箱压力升高的情况，如果冻干箱内的压力无明显升高，说明干燥已基本完成，冻干可以结束；如果压力明显上升，则说明还有水份逸出，还需继续进行干燥，直至再次试验时，压力无明显上升为止。一般在关阀后30～60 秒内，压力上升不超过3～8Pa，此时产品含水率通常约在0.4%～2%之间。在产品出箱前，箱内温度最好回复到室温，这样可避免产品出箱后冷却吸湿，另一方面也不会对房间温度造成大的波动。
2 干燥阶段的水分控制
干燥过程对水分的控制是保证冻干制剂质量的关键，说到水分控制我们必须先引入玻璃态转化温度（Tg）的概念，有些液体非晶态物料在被冷却固化过程中不经过相变，而是连续地固化成玻璃体，这个过程称为玻璃化转变，所对应的温度称为Tg。当物料到达这一温度时，很小的温度就可能引起冷冻浓缩液黏度的显著增加，同时冰的结晶停止。无论是第一、第二干燥阶段还是贮存中的制剂温度都必须控制在Tg以下，否则冷冻浓缩液将会发生流动，破坏了冷冻建立起来的微细结构，就会发生塌陷。对于冻干制剂药品水分含量的控制，水分含量越低，其Tg越高，药品越能长期稳定地储存，通常冻干制剂的水分含量要求控制在1％～3％之间，以保持稳定。用动力学方程计算可以选择冻干终产品更合适的水分含量，既能满足药品在保存期稳定的要求．又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费。另外，有研究表明瓶子的胶塞氯丁基橡胶塞要比溴丁基橡胶塞对水分的透过率高，故除了要选择适宜的湿度环境保存，也要选择合适的包装材料。
冻干制剂在一次干燥后往往都要进行二次干燥，二次干燥又叫解析干燥，主要干燥一次干燥残留的一些未被冻结的吸附水和结合水，这些靠升华无法去除的水分要靠蒸发来去除，这部分水分一定量时会为微生物生长和某些化学反应的进行提供了条件，所以必须得到去除。最终冻干制剂含水量偏高主要原因 1）解析干燥时间太短，干燥温度太低；2）干燥层和瓶塞的流动阻力太大，半压塞太深，水蒸气不易析出。3）装量太厚，一般是10-15mm，不宜超过15mm。4）产品贮存期间，水蒸气通过瓶塞等包装不密封处进入。
3 干燥阶段塌陷（崩解）温度(Tc)
冻干产品在升华干燥阶段，随着升华时间的增长，产品中会出现已干层和冻结层，这两层之间的交界面是升华面，随着升华的进行，升华界面不断向减小冻结层方向移动，干燥层厚度逐渐增加。已干层产品结构应该是疏松多孔的，并保持在稳定状态，以便冻结层升华出来的水蒸气顺利通过，是全部产品都能干燥良好。但某些已干燥的产品当温度升高到某一数值时，会失去刚性，变成粘性，发生类似塌方的崩解现象，使干燥产品失去疏松多孔的状态，堵塞了冻结层产品水蒸气升华逸出的通路，妨碍了升华的继续进行。于是升华速率变慢，由搁板供给冻结层的热量将有剩余，引起冻结层产品温度上升，当温度上升到共晶点温度以上时，产品就会发生熔化或产生发泡现象，致使冻干失败，这时的温度叫崩解温度。有些产品的崩解温度高于共晶点温度，升华时只需要控制产品温度稍低于共晶点温度即可；有些产品的崩解温度低于共晶点温度，这样的产品应以控制崩解温度为准，在较低的温度下升华，势必要延长干燥时间。产品的崩解温度取决于产品本身的物性和保护剂的种类。混合物的崩解温度取决于各组分的崩解温度。因此在选择产品的冻干保护剂时，应该选择具有较高崩解温度的材料，使升华干燥能在不太低的温度下进行，以节省冻干时间和能耗，提高生产率，降低成本。
产品的崩解温度不好测，只有在冷冻干燥显微镜下直接观察得知，表1给出一些物质的崩解温度值。
表1 一些物质的崩解温度
上面我们共提到的温度点有共晶温度、崩解温度和玻璃态转化温度。一般来说，崩解温度Tc比共晶温度Te稍高，也有少数产品崩解温度Tc比共晶温度Te低。共晶温度Te比玻璃转化温度Tg高。一般Tc要比Tg高20K左右。DSC是传统的测定Te和Tg的方法，迅速、精确、样品用量少、灵敏度高。Tc只能通过冻干显微镜测得。值得注意的是，有些物料没有或不需要研究Tg，有些物料没有Tc。这几个温度参数只与物料的成分、性质和加入的添加剂成分、性质有关，受工艺过程参数影响不大。对于具体物料，如果查不到需要的有关数据，这时测试相关的参数是有必要的，而研究这些参数的测试方法和测试结果的正确性是很重要的。
四 冻干辅料探究
1 冻干溶剂
冻干的常用辅料包括溶剂和冻干保护剂，在说到冻干保护剂前，先了解一下溶剂，常用溶剂包括注射用水、乙醇、丙二醇、正丁醇、异丙醇、叔丁醇、聚乙二醇。拿冻干粉针剂来说，冻干粉针剂的药物和所使用的各种辅料必须有极高的纯度，且无微生物污染和毒性成分。注射剂溶剂首选注射用水，当注射用水不能满足药物性质和临床要求时，才会考虑其他非水溶剂。其中在冷冻干燥中常见的有机溶剂是叔丁醇。在有机混合溶剂存在下，增加了低压冷冻干燥时药物的稳定性，提高升华速率和缩短冻干时间等。由于非水溶剂的刺激性和毒性，通常采用一种或几种非水溶剂和注射用水的混合溶剂。乙醇作为溶剂浓度可高达50%；丙二醇作为溶剂比甘油更好，溶解性也好，还可作为渗透性保护剂；聚乙二醇在制剂中应用广泛。
我们主要来研究一下叔丁醇，叔丁醇在冷冻干燥中采用叔丁醇和水的系统（3%-19%的叔丁醇）为溶剂，可改变晶体特性，形成针状冰晶，提高干燥效率，缩短干燥时间。叔丁醇作为冻干溶剂还有一个独特的优点，其溶剂自身在冻结中形成针状结晶，能改变溶质的结晶方式，利于升华。而当少量的叔丁醇加入到水中形成叔丁醇-水共溶剂后，在可以改变水的结晶状态，在冻结过程中形成针状结晶，具有更大的表面积, 同时冰晶升华后，留下了管状通道，使水蒸汽流动阻力大大减小，升华速率显著提高，因此可用叔丁醇来加快冷冻干燥过程中的传质过程。叔丁醇可以单独使用，也可以与水任意比混合形成共溶剂体系进行冻干。单独使用时溶解水不溶性药物或水中稳定性不好的药物。另外有研究以叔丁醇作为溶剂溶解磷脂，经冻干后得到结构酥松的磷脂固体，加入水可以迅速水化制成脂质体。这种方法类似薄膜分散法，可以制得粒径较大的微米级多室脂质体，这种脂质体制备工艺已经应用于试验和规模生产。目前更多是叔丁醇与水形成共溶剂体系进行冷冻干燥的研究，其在药剂领域中应用总结起来主要在固体制剂（难溶于水的药物溶于叔丁醇中，水溶性物质溶解于水中，两者以适当的比例混合，得到可以共同溶解水溶性与脂溶性物质的澄明共溶剂，此溶液经进一步冻干可以得到固体分散体。可加快药物升华速度，缩短冻干周期，提高药物稳定性，增溶难溶性药物，简化制备固体分散体工艺，促进药物的结晶。）、分散体系（脂质体制备、非离子表面活性剂囊泡的制备、高聚物胶团的制备等）、工艺路线改进（蛋白质-多肽的磷脂分散体的制备、难溶性药物在水中的溶解度等）三个方面。
理想的冻干溶剂需要如下条件：凝固点高、挥发性强、最好能与水混溶。众多有机溶剂中，叔丁醇被认为是最适合的冻干溶剂，主要原因如下：①凝固点高，纯的叔丁醇在室温下（25 ℃）就可以冻结，与水混合后也可以在零下几度冻结，在现有的冻干机中都可以完全冻结。其他的一些有机溶剂如乙醇等凝固点低，一般都在零下几十度才能冻结，一般的冻干机无法将其冻结捕获，最终都进入到真空泵中，因而在实际生产中无法使用。②叔丁醇的蒸汽压较高，蒸汽压高有利于升华，节省冻干时间，而另一种有机溶剂二甲基亚砜, 尽管凝固点在18.4 ℃，但蒸汽压较低，升华困难，很难用于冻干。③ 叔丁醇与水可以任意比例混合，这点也很重要，可以增大一些脂溶性药物在水中的溶解度，同时对一些水溶液中不稳定的药物，加入适量的叔丁醇可以抑制药物的分解，增强药物的稳定性。而环己烷虽然在室温条件下也可以冻结（6.5 ℃），但几乎与水不互溶，只能用于脂溶性药物，极大的限制了它的应用范围。④ 叔丁醇毒性低，作为药用的辅料，叔丁醇的毒性很低，在冻干过程中，大部分叔丁醇可在一次干燥阶段升华，在制剂中残留量很低，可以安全的用于制剂生产中。采用叔丁醇-水共溶剂为溶剂进行冷冻干燥的工艺可以用于多种制剂的制备，在很多方面具有优势。对这项技术进行深入研究，对药剂学基础理论和实际应用具有重要的意义。
2 冻干保护剂
加入冻干保护剂的目的是为了提高冻干产品的质量：赋形剂，可使固体物质的质量分数在4%-25%之间，冻干后形成疏松团块结构；胶状物质可防止冻结前溶质沉淀和冻干后发生破碎；一些物质可做pH的调节剂，提高崩解温度使产品易于干燥；抗氧剂可改善产品的贮藏稳定性和提高其贮藏温度；一些抗冻剂或保护剂可防止一些具有生物活性或病毒等因细胞膜破裂、细胞脱水、细胞质浓缩的等而死亡；一些保护剂可减小或抑制储存过程中活性成分变化，蛋白质的变性和聚集。冻干制剂对保护剂要求很高：纯度高，无抗原性，无毒性；可形成均匀混悬液或溶液，冻干后形成团块，不破碎；在冻干和储存期中对产品有保护作用，但不与活性成分产生化学反应，不破坏药物的活性；其崩解温度和共晶点温度应尽量高，以保证不形成玻璃化冻结外壳；易除热源，引湿性好；冻干升华时不起泡；干燥后复水性好；不影响对冻干制品的检测。
几种常用的赋形剂：2.5%-20%的葡萄糖可减轻注射给药的疼痛感；葡聚糖具有较高的玻璃转化温度，能在酶蛋白分子周围形成玻璃态，从而保护酶分子免受高温所引起的损伤；甘露醇（20%-90%，w/w）作为载体可形成疏松结实的均匀骨架，改善了制剂产品的外观；氯化钠早期常作为赋形剂，但单独使用盐类冻干后饼状物体积多明显缩小，并出现硬壳和脆散，现在已少用；山梨醇与甘露醇相似，一般作为赋形剂；乳糖加入冻干溶液中可增加体积，并有助于冻干块状物的形成；聚氧乙烯吡咯烷酮（PVP）可明显提高蔗糖的玻璃转化温度Tg值（P<0.05），高分子量的PVP能更好的抑制蔗糖结晶，并通过稳定糖的玻璃态结构，共同提高冷冻干燥过程中蛋白和氨基酸的稳定性；海藻糖为葡萄糖的二聚体，为稳定的非还原性双糖，广泛用于血细胞等冻干保存，作为保护剂冻干的样品生物性能比较稳定，保存时间长，是低温生物领域最佳的保护剂，它分子量较小，易于填充到蛋白质分子空隙中，有效限制蛋白质分子内部的结构变化，避免失活，玻璃化温度比蔗糖高，但未被各国药典收载；蔗糖在冻干粉制剂中是常用的骨架赋形剂，在蛋白质类药物冻干时，主要作为填充剂对粒子赋型；麦芽糖可作为冻干粉针剂的赋形剂或脂质体、蛋白质的冻干保护剂；右旋糖酐1,40，70可用于注射剂型。
抗冻剂甘油在较低温度下倾向过冷而不结晶，浓度一般为40%，过高干燥阶段易产生气泡、融解现象。甘油使胞内体系的体积分数更容易达到玻璃态转化温度，可阻止蛋白的伸展和沉淀，维持蛋白分子三维结构的稳定，起保护蛋白作用。酸碱度调节剂有柠檬酸，乳酸，柠檬酸钠，氢氧化钠，碳酸氢钠。增溶剂和其他附加剂有聚山梨酯、卵磷脂等。
3 一些保护剂在蛋白和多肽的冻干制剂中的应用
甘露醇是一种多羟基化合物，不仅可作为优良的骨架剂使用，也能兼作渗透性调节剂及蛋白质的冻干保护剂。氨基酸也是一种常见的蛋白质保护剂，研究发现，两种低浓度的氨基酸(谷氨酸和精氨酸)对PEG—rhlFNot2b的冻干保护作用非常显著，可能是因为：①二者一个是酸陛氨基酸，一个是碱性氨基酸，加人后使制剂具有了更好的缓冲能力，提高了蛋白质在冻干过程中的稳定性；②氨基酸的玻璃化转变温度相对高于非氨基酸缓冲剂，因此可能对冻干制剂的稳定性起到了一定作用；③氨基酸的另一种可能的保护机制是在冷冻过程中与蛋白共浓缩，从而起到了稀释和保护蛋白的作用；④在冷冻和冻干过程中，两性的氨基酸分子与蛋白分子之间发生特异的相互作用，保护蛋白不变性。
糖是最常见、使用最广泛的一类冻干保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂，在冻干的各个阶段均能对蛋白质起到一定的保护作用。蔗糖和海藻糖都是二糖，其中蔗糖化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止蛋白质二级结构改变以及冻干过程中及储存期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。蔗糖也有一个相对较高的玻璃化转变温度，使其在冷冻状态下与蛋白质共浓缩，起到了稀释蛋白质的作用，从而防止了聚合，并且维持蛋白分子的结构。另外蔗糖、海藻糖以及甘露醇上的羟基能替代部分结构水，与蛋白中的羰基和氨基结合形成的氢键使其在缺水的条件下仍能保持原有结构，而不丧失活性。蔗糖具有比其他多元醇更优越的水置换特性。海藻糖的作用与蔗糖相似，但比蔗糖具有更高的玻璃化转变温度和更低的引湿性，且更不具有还原性。
4 常用细胞冻干保护剂的应用
海藻糖在对生物膜保存的研究中发现,海藻糖无疑优于其它糖。这并非说其它糖类不能保护细胞膜,实际上蔗糖也能起到很好的保护作用,但它需要更高的浓度。在一般的冻干保存中,糖类一般与大分子聚合物共同使用,原因是大分子聚合物对细胞冻存过程中的相变没有影响,但可抑制细胞间的聚集和蛋白的融合,而糖类则可降低熔点值(Tm)。在细胞冻干过程中,对细胞磷脂囊泡的保护有2个必要条件:抑制囊泡间的融合,在干燥情况下降低Tm值。在溶液状态下,此种物质的Tm值为-1℃,若在不加海藻糖的条件下干燥,Tm上升到70℃,若在干燥过程中有海藻糖的参与,Tm被抑制到-20℃,冻干物质可维持在液晶状态并在复水过程中不发生相变。大分子聚合物和糖类这2种物质的联合应用满足了细胞有效冻干的要求。当然,越来越多的研究证明,只有进入到细胞内部,海藻糖在冻干时才能对胞内蛋白和细胞膜起到有效的保护作用。
聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone,PVP)是一种多聚体,它对生物体或生物大分子具有非特异性保护作用;同时它也是一种非渗透性保护剂,在细胞冻干保存中常与糖类一起,主要通过与糖类间的氢键作用和改变糖类的玻璃化温度发挥作用,不同浓度和不同分子量的PVP的作用不一样。大分子量的PVP能够更有效地抑制蔗糖的结晶作用,通过稳定糖类的玻璃化结构,这些多聚物还可以提高共同冻干的蛋白和肽类的稳定性。增加PVP的浓度和分子量也可以增加非结晶型糖类的物理稳定性。
盐类在冻干中的作用 溶液在结冰时,其中的溶质浓度必然会慢慢增大,盐类产生的电解质离子可明显降低其Tg值,比如在10%的葡聚糖、PVP、乳糖和蔗糖的溶液中加入2%的NaCl可使Tg值下降14~18℃。磷酸钠对Tg值的影响较小,但是当将10%的PVP溶液中加入1%~%的磷酸钠可以引起在低温热能曲线中的第2个玻璃化,暗示了在冻干液中的相分离。电解质诱导Tg值变化的最可能的机制是它可以增加冻干液中非冰冻水的含量,而这非冰冻水起到了增塑剂的作用,并且降低了Tg值。有些盐类会分离蛋白和PVP联合,在冰晶中把它们分成蛋白富集区和PVP富集相,这一结果强调了在冻干保护液中减少盐加入量的重要性。
为了获得在冻干前后形态一致和功能稳定的细胞,很多糖类或多聚物经常被用做溶液冻融和冻干过程中非特定蛋白质和膜的稳定剂,它们既是有效的低温保护剂,又是很好的冻干保护剂,它们对冻结的影响取决于种类和浓度。但是细胞种类很多,所含蛋白也不尽相同,而且物理化学性质各异,因此不同的细胞需要不同的保护剂。在选择冻干保护剂的配方时,必须进行大量严格的试验,这对任何一种细胞冻干工艺的探索都是一项极为重要的工作。
五 冻干制剂稳定性研究
我们这里只对多肽类和蛋白质的制剂的稳定性探究,多肽类药物冻干制剂在生产和贮存过程中,经常会出现药物失活现象,有时在其制剂表面还会出现凹凸不平或萎缩等现象，引起这些现象的因素很多。
首先是上述中谈到的玻璃态转化温度（Tg），在生产过程的第1、第2干燥阶段以及储存过程中,药物温度都必须低于与其浓度变化相应的Tg,否则就会影响制剂稳定性,从而影响冻干制剂的外观和内在质量。但干燥温度过低,干燥时间就要延长。为了既保证药物在干燥过程中温度低于Tg,又缩短干燥时间避免能源浪费,最好的方法是提高药物溶液的Tg,即加入Tg高的保护剂,如甘露醇、海藻糖等。
其次是上述谈到的水分控制，冻干制剂中的剩余含水量,对于多肽及蛋白质类药物稳定性的影响很大,尤其对其活性的复性影响最大。一般认为其含水量越低,则Tg就越高,该制剂越能长期稳定地储存，但并不是剩余含水量越低越好。研究表明不同结构的多肽及蛋白质类药物的冻干制剂对于剩余含水量的需求是不一样的。就某一种多肽或蛋白质类而言,剩余含水量过高过低都不利于其稳定。追究其原因,可能是每种多肽类或蛋白质类药物都含有适合于一定剩余水分来稳定的基团,剩余含水量较低或过度的干燥可使多肽分子的这些基团(如极性基团或分子表面的氢键)变化而导致变性;过多的水分可使多肽及蛋白质类药物发生氧化变质的几率增多而导致变性。因此,控制适宜于多肽及蛋白质类药物的剩余含水量,这既能满足冻干制剂在保存期稳定的要求,又避免在生产中因过度干燥而引起能源浪费。
为了提高药品的稳定性,必须对药品在冻干过程中的损伤和保护机制进行进一步的研究,优化冻干工艺。预冻过程中一般认为主要是由机械效应和溶质效应引起。邬霞等研究了冷冻保护剂能避免超低温冷冻过程中的溶质效应。干燥阶段,应该在保证药物活性的条件下,选择能允许的最高温度进行第2阶段再干燥。在该过程中,为了将干燥应力的破坏作用降至最低需要加入干燥保护剂,包括保持玻璃化的干燥剂,以保证多肽分子表面的单层水分子不受到破坏。
干燥好的制剂出箱后要及时密封,否则与空气接触后容易吸潮、产生萎缩等现象。因此,干燥好的制剂在出箱前必须注意干燥箱温度要高于环境温度;需充入高纯氮气进行保护;并尽快进行密封处理。随着冷冻干燥机的不断改进,目前多采用箱内真空密封或充氮气密封。
冻干保护剂及其保护机制:从上述生产工艺过程中笔者得知,冷冻干燥是一个复杂的过程,其过程中产生冻结应力(包括枝状冰晶的形成,离子浓度的增加,pH值的改变和相分离等)和干燥应力(主要是指移去多肽分子表面单层水分子)等
都会使多肽及蛋白质类药物变性。为了防止药物变性,通常都在其制剂配方中都添加了不同的保护剂,加入的这些保护剂一般应具有吸水性差、玻璃转变温度高、结晶率低和不含还原性基团等特性。常用的保护剂见表2。通常认为,无定型甘露醇具有使多肽及蛋白质类药物稳定的作用,而结晶态的甘露醇则没有稳定功能,如有文献报道,1%或更低浓度的甘露醇通过无定型结构的形成而阻止蛋白质药物的聚集,但是高浓度的甘露醇则易于形成结晶态而促进蛋白质药物的聚集。而与甘露醇或其它糖类相比,海藻糖的玻璃转化温度更高、引湿性和还原性更低,具有更广阔的应用前景。氨基酸也是常见的蛋白质保护剂之一,在冷冻过程中,低浓度的甘氨酸可通过抑制磷酸缓冲盐结晶所致pH值的改变而阻止蛋白质药物变性。
贮存温度可能是影响冻干药品稳定性的最重要因素之一。冻干药品贮存过程中,温度必须低于其Tg,如环境温度超过冻干制剂的Tg,药品的玻璃化状态被破坏,分子运动加快,无定形成分结晶增加,会出现塌陷、表面萎缩、结块、变硬、变色
等,同时制剂的多孔网状结构被破坏,复水能力减弱。但有时贮存温度不稳定比单纯高温对药物活性影响更大。残留水分是又一重要因素。总的来说,冻于品越干燥,含水量越低,其Tg就越高,越容易长期稳定地保存,但过度的干燥会使某些药品表面的氢键或极性基团因暴露而变性。干燥后的药品必须封口保存,以防止污染及回潮。不同药品对封口的要求也不一致,一般对活的微生物、毒株、菌种要求真空封口,对易氧化变质的药品可以采用充氮封口,一般药品可采用普通封口。冻干药品长期贮存时,封口胶塞对药品稳定性也有影响,是由于水分经胶塞进入瓶内使药品中残留水分增加所致。高压蒸气灭菌时水分也可经胶塞进入药品中。
六 冻干过程中和冻干后的一些问题汇总
1 喷瓶现象
喷瓶是影响冻干制剂外观质量的重要因素，喷瓶的原因主要在三个方面，药液中的气泡、预冻、干燥速率。
制品在分装过程中，当灌装机溶液分注入瓶中时，由于液体流速较快，形成一定量的气泡存在于瓶内液体中，此时应将装瓶液体放置一定时间让气泡充分逸出，否则旗袍被冻结在制品内部，当升华过程抽真空减压时，气体逸出带有部分制品黏附于瓶壁上。
冻结过程预冻温度不够低或保持时间不够长，未能使溶液全部固化，真空升华干燥时，溶液的温度至共晶点时，溶液和水同时结晶析出，液体沸腾，造成喷瓶。应严格控制预冻温度，预冻温度比共晶点温度要低15摄氏度保持2~3h，就可以保证冻实。
升温过快造成制品上下温差过大，下部制品的结晶不是从固体到气体升华，而是从固体、液体到气体蒸发，形成喷瓶。这样就造成制品上不均匀、疏松，呈海绵状的理想外观，下部则呈硬结和不规则的空穴，严重时可造成产品报废。因此应该严格控制升华干燥阶段特别是在共晶点附近的升温速率，均匀且不宜过快。
2 结晶
冻干箱在预先冷却时箱内有许多水分结霜于隔板上，产品进箱时，霜从隔板中掉入产品中结晶中心，从而使产品结晶。产品预先加塞或加盖，或者产品进箱后再开机预冻。最近可能在研究全自动冻干机，实现冻干后自动压塞，同时期待着此设备能够解决不提前半压塞，解决结晶问题。
3 掉底
掉底发生在预冻抽空阶段，一般是未冻实的液体于真空下快速蒸发，沸腾放热时发生。放热时产品本身温度急降，达到共晶点温度，于瓶底接触的搁板层并没有以上蒸发冷冻特性，玻瓶承受不了短时间的如此大的温度。所以预冻阶段要冻实。
4 破瓶
玻璃瓶在均匀受热或受冷在一定温度下是不破碎的，但在不同部位施加不同温度形成一定温差，就会破碎。所以要缩小玻瓶各部分的温差，在冻干曲线上体现的是缩小隔板温度曲线和样品温度曲线之间的温度线差异。要控制样品温度和隔板温度的温差小于20℃，既缩短了冻干周期，也解决了破瓶和脱底现象。当然破瓶也和瓶子质量还有冻干机性能有关。
5 产品上升
与真空度有关，升华过程中，泵组真空度很大时，突然大开大蝶阀，箱内真空度会大幅上升，从而导致产品上升，在操作过程中先慢慢打开大蝶阀，再开罗茨泵。
6 分层
在升华过程中，停机10min以上或干燥箱漏气会导致分层，产品进箱时减检查密封条有没有老化，在四周涂上真空脂。停电或断电后应立即关闭真空阀碟，让产品处于真空状态。
7 产品外观
产品外观良好表现在颜色均匀、孔隙致密、保持冻干前体积、性状基本不变、形成海绵状块状结构。
有时产品出箱前质量看上去很好，出箱不久就萎缩了，或出现空洞、碎块。主要因为产品干燥不彻底，还残存冰晶、出箱后产品的温度压力均处于共熔点以上，冰融化成水，水被周围的已干物质吸收，产生空洞萎缩现象。干燥不彻底就是干燥时间不够长或温度太低，或两者都有；要不然就是冻结速率太快、晶粒太细，使升华速率变慢；或者冻结不彻底；或冻干后成品密封不好吸收了空气中的水分而发生萎缩，可采用充氮气方法。
产品出箱时是间隙很大的骨架结构，甚至是绒毛状结构，出箱后绒毛状结构物质很快消散。原因是产品配方中所含的固体物质少，冻结时自由水结成纯冰，所占体积大，升华后形成的空隙也很大，可有用的成分在升华时随水蒸气一起分散，形成毛绒状物质，一遇空气会吸水蒸气而消失，应加入适量填充剂来解决。
产品出箱时，出现泡坑、干缩、塌陷、空洞等缺陷。原因是冻结温度过高，或时间太短，产品为完全冻结；或干燥阶段温度过高，压力过大。使部分产品融化所致。在尚未冻牢就抽真空升华，外部压力迅速降低引起鼓泡；熔化了的产品产生蒸汽浓缩，就会萎缩；部分未干产品加热剧烈而熔化，将会使已干物体熔化
而成空洞塌陷。因此一定要冻实，升华不能超过产品的共晶点温度和崩解温度。
产品在深度方向上颜色和孔隙不均匀，由于分装后搁置时间过长，溶液中部分物质析出或不能溶解成分发生沉淀。
产品外观的影响因素还包括溶液浓度、放气速度。溶液浓度一般控制在10~15%之间，小于5%的要加赋形剂，浓度太高的话应控制厚度，一般在10~15mm。若溶液浓度大于30%但是，则制品易出现萎缩、塌陷、不饱满的情况。另外，干燥时冻结的表面最先脱水形成结构致密的干燥外壳，下面升华的水蒸气从已干燥表层的分子之间的间隙逸出。这时如果溶液浓度太高，分子之间的间隙小、通气性差，水蒸气穿过阻力较大，大量水分子来不及逸出，在干燥层停滞时间长，使部分已干燥药物逐渐潮解，会使制品体积收缩，外形不饱满或塌陷。如果药液重量浓度低于4%，在抽真空时，药物会随水蒸气一起飞散；或在干燥后变成绒毛状的松散结构，在解除真空后，这种结构的物质会消散，使制品成空洞状。还有一种情况是药液浓度太低，使制品疏松易引湿，同时由于比表面积过大，使制品容易萎缩，干燥的成品机械强度过低，一经振动即分散成粉末而粘附于瓶壁。在冻干工艺方面，如果药液厚度大于20mm，干燥时间延长，也会造成产品外观不合格。另外，在开始冻结时降温速度快，使制品形成细结晶，密度大，升华受到阻力较大，水分不易蒸发掉，制品会逐渐潮解致使体积收缩而造成外形不饱满或形成团状。如果冻结速度过慢，冰晶成长时间较长，则易发生浓缩，致使药物与溶剂分离、成品结构不均匀。措施：合理设计冻干溶液的配方。一般重量浓度在4%~25%之间为宜，最佳浓度在10%~15%。若浓度低于4%，可适当添加赋形剂(如甘露醇、右旋糖酐、乳糖等)。若浓度较高时，则必须控制冻干制品厚度，或降低浓度，改用大的容器灌装药液。冻干过程中降温速度应控制在每小时降低5℃~6℃。在一期升华干燥阶段，制品温度应低于共熔点，升温不宜快，控制在每小时5℃左右。如果加热过快，在制品有大量水分时，温度超过其共熔点，就会导致制品溶化，外观出现缺陷。在二期升华阶段，虽然此时制品中含水量已较低，升温速度可以适当提高，但要将温度控制在安全温度以下，否则会有结块。另外，制品包装的气密性不好，在有效期内也会出现外观不合格甚至内在质量不合格。
8 水分（含水率）
含水率在上面水分控制中提到，这里就不再说明。
9 其他问题
有时我们的产品在冻后还会发生回溶、澄明度不好、生物物质失活、含量不均匀或偏低、复溶不溶性微粒不合格等。
复溶不溶性微粒不合格有丁基胶塞有静电吸附作用，清洗未能清洗表面颗粒；或压塞产生微粒等，要选择光滑的胶塞，减轻静电吸附作用。
七 冻干制剂的冻干周期缩短
有调查中提到目前国内冻干制剂的冻干周期较长,影响产品的产量和经济效益。国产冻干机的运行,一般每1小时约需水5~8吨,用电功率约20~25kw,运行时间长达20~40小时。这样长的运行时间内,在某一个方面稍出故障,往往导致重新运行,对生产更为不利。综合种种原因,如把冻干周期安排在20小时左右是较为理想的。这样做优点有三：一是节约水电,降低成本,二是在20小时以内设备不易发生故障,可顺利完成一个周期,三是提高设备利用率,增加产量。据我所知，对于时间上可能会有的需要冻干40-70小时，一般是因为装量深度大或产品浓度高引起的。
制品的降温过程分为预冷、凝固和深冻三个阶段来掌握。在预冷阶段降温速度要尽量快,可调整制冷机至最大负载。当制品开始凝结固时应适当减慢,而在深冻阶段再适当加快。
加热的目的是使制品中结晶后的固态水不断获得能量而飞向凝结器。若加热速度快,制品获得能量充足,则升华也快。对理想的冻干设备,可一次将制品加热至升华完毕深度干燥前的温度并加以保持,则可获得最快的升华速度。对目前一般制药厂使用的冻干机可根据凝结器温度、系统的真空度和升华情况等,进行以获得快速冻干为目标的随机调整。一般使凝结器的温度保持于-50~-60℃,系统的真空度保持在0.1~10Pa的范围,即可通过不断观察制品的色泽变化,而将升温速度调至每l小时10~15℃左右或更快一些。这样虽然不如一次加热至深度干燥前的温度理想并简单,但也能基木上达到明显缩短冻干周期的目的。欲使升华速度快,而同时不致由于过快而导致冻干过程的失败,对几个相关的条件必须重视。原则上要使升华速度快,就要补充足够的热量,但如热量补充过多,使制品温度高于其最低共熔点时,冻干就会失败。温度升过最低共熔点的原因较多,如热量的转移方式、系统真空度的高低、防尘盖布的疏密情况和制品结晶颗粒的大小等因素都直接或间接影响制品热量的得失速度,且上述各因素又是在一定条件下相互制约的。例如:当制品获得热量的转移方式是主要靠对流,则系统不要有过高的真空度,也即不要过低的压力,但在此条件下,水蒸汽在流动过程中会受到一定的阻力,使升华变慢,如掌握不好,只考虑对流,即使其效果很好,对整个过程仍是不利的。总之,应将降温速度,加热速度和升华速度联系起来,通盘考虑,将三者关系调整理顺, 并在整个过程中随时观察,按一定规律进行控制,可明显缩短冻干周期。对凝结器的降温要快,应尽可能将制冷状况一次控制好,或在对制品起作用前调准。在以后的运行中,一般由其自行调节即可。这也对缩短冻干周期有利。
为达到缩短冻干周期的目的,我们对冻干曲线进行了适当调整,对设备和器材进行了一些改动。对冻干曲线,按工艺要求分三个阶段进行调节控制,即冻结、升华和再干燥。制品的冻结时间,一般控制为6小时。深冻时依不同品种规定最低温度值。升华干燥阶段可按每1小时10一15℃的速度调节升温,时间也约为6小时。再干燥即深度干燥阶段一般需6小时以上,我们控制不得少于6小时。在总计约为2。小时的冻干操作过程中,应按照温度范围的要求,灵活调节。气体分子在两次连续碰撞之间所走的平均距离即所谓平均自由路程,与压力成反比。在压力降低至系统应达到的真空度范围时,平顺自由路程将增大万倍以上,升华飞离出来的水份很少改变自己的方向,从而形成了定向的蒸汽流。在冻干机的干燥箱与凝结器间有一挡自水板,其主要作用是在冻干结束后凝结器用冲霜时防止飞溅的水污染制品。我们只要在取出制品后再冲霜,就可避免污染。在这种情况下,可将挡水板拆除,减除了升华后的水分对此板的碰撞,从而加快了升华速度。与上述同样的理由,在冻干中用于防止制品污染的布,要考虑其适当的疏密程度。我们将原使用的240目布改为120目布后,加快了升华速度,产品仍能达到卫生部门规定的对冻干制剂的质量要求。
小结
冷冻干燥是一门综合性专业技术，它涉及到物理、化学、生物学知识，包括制冷、真空、电工、电子、仪表等技术。在研究生物冻干制剂的冻干工艺过程中, 要考虑到产品的理化特性、药液的分装厚度、瓶颈的大小、冻干机组的控温和抽
真空能力等一系列参数，并对溶液中溶质中浓度、选择的保护剂加以优化，以及预冻、抽空、升华干燥、解析干燥、压塞、贮存等步骤中对温度、压力、时间等参数的控制，做出合适的冻干曲线，制订出更为合理的冻干工艺，对冻干产品质量、缩短生产周期和降低成本都起着不可忽视的重要作用。
