今天这篇文章其实是讲的肿瘤的表达编程对于微环境免疫细胞的影响，他们也提出了应对的治疗方案，就是使用DNA甲基化抑制剂。这篇文章就是北京大学张莹团队发表在27.7分的Nature子刊Nat Immunol上的文章，我们一起来看看他们是怎么做的：
这篇文章是从肿瘤早期和晚期之间发展的差异开始的，首先他们采用了诱发的肿瘤小鼠模型，然后进行了分组，分成了早期肿瘤和晚期肿瘤两种，进行了单细胞测序（下面图里的UMAP图，其实就是对于单细胞测序过程中产生的多维PCA进行降维处理后，分析细胞分簇的，不清楚的话，可以去看看《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》，都介绍过）。他们发现早期肿瘤中会有免疫相关基因增多，而晚期肿瘤模型中，免疫相关基因表达会降低，其实这也就说明了肿瘤可能引发了免疫逃逸：
那么对于单细胞测序的基因表达具体差异进行分析后（下面的火山图应该也能理解吧，左侧的是下调基因，右侧是上调基因，而通过聚类则能看出具体的表达差异基因的数量，不清楚聚类分析和火山图的话可以去看看《轻松的文献导读》和《夏老师带你读文献》），可以发现肿瘤在进展过程中，免疫及炎症相关的通路和基因都会表现出下调：
其中肿瘤的GSDMD、NLRP3和RIP3K的表达极低（这仨大家应该比较熟悉了，在坏死性凋亡、焦亡等信号通路中，都是比较常见的特别是NLRP3组成的炎性小体，不记得的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列），这就说明了，在肿瘤进展的过程中，存在这这样的基因编辑，通过抑制肿瘤的炎症因子的表达，产生免疫逃逸。而对于单细胞测序的进一步分析，他们发现晚期肿瘤中，肿瘤浸润的CD4+ 和 CD8+的幼稚T细胞的比例显著下降，而祖细胞耗竭和耗竭的CD8+ T细胞在晚期肿瘤中增加：
接着他们使用CellChat对单细胞测序数据进行了分析，这个是分析细胞间配体受体表达情况的，特别是在单细胞测序结果中，分析不同细胞簇中配体和受体的表达情况，可以显示细胞间的Crosstalk。他们发现，早期肿瘤中的多种配体与受体的相互作用，在晚期肿瘤中会明显减少或检测不到，这些细胞因子都参与免疫细胞募集和功能。也就是说，随着肿瘤的进展，肿瘤和浸润免疫细胞的基因表达变化，都会降低浸润肿瘤的免疫细胞对于肿瘤的免疫监视：
接下去的转折有点突然，在没有前提的情况下，他们假设DNMT可能会在晚期肿瘤中，通过启动子甲基化抑制基因表达。于是他们使用了DAC（地西他滨，抑制DNA甲基化的）对晚期的肿瘤小鼠模型进行治疗，结果发现DAC可以提高晚期肿瘤小鼠模型的肿瘤免疫原性和免疫控制。抑制DNA甲基化，可以强烈抑制GEMM肿瘤生长并重建抗肿瘤免疫：
用原位接种4T1三阴性乳腺肿瘤的小鼠进行验证，也发现DAC能有效抑制三阴性乳腺癌增殖，并重新激活肿瘤免疫。那么，DAC的作用是否是影响这些重编程的基因表达呢？他们通过表达验证发现，DAC治疗后上调的基因，与晚期肿瘤中下调的基因重叠。也就是说，DAC的抑制肿瘤促进肿瘤免疫的作用，很有可能是通过影响肿瘤中基因表达的重编程导致的：
这两组体内实验，都是为了说明通过抑制DNA甲基化，影响肿瘤的表达重编程，激活免疫反应的过程。那么抑制了肿瘤细胞的DNA甲基化，是否会直接影响免疫细胞呢？或者说是否是通过免疫细胞，对肿瘤产生了抑制呢？于是他们通过抑制CD8+ T细胞中的PFN（穿孔素），缺失了PFN，则CD8+ T细胞无法实现细胞毒性作用（这其实就是柯霍氏法则的验证，通过抑制CD8+ T细胞这样的细胞毒性T细胞，来确定DAC的具体功能，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），结果发现移除了CD8+ T细胞功能后，的确DAC对肿瘤的抑制作用减弱了。
那么先天的免疫通路，都有哪些会受到DAC影响，诱导对肿瘤的免疫会呢？于是他们通过对不同的先天免疫缺失的基因小鼠进行B16（小鼠黑色素瘤）移植进行分析：
结果发现DAC可以显著延缓GSDMD缺失小鼠，以及野生型小鼠的肿瘤生长，而DAC不能影响IRF3、IRF7、GSDME、RIPK3（GSDME和GSDMD都是引发细胞焦亡的关键基因，但是所属的途径其实并不一致，RIPK3则是诱导坏死性凋亡的关键激酶，IRF则参与了很多免疫相关的信号通路，不清楚这些信号通路的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列）这些基因缺失的小鼠模型的抗肿瘤免疫。也就是说，DAC的活性取决于细胞毒性淋巴细胞，同时可以通过坏死性凋亡和GSDME介导的细胞焦亡以及IFN-I途径，从而抑制肿瘤生长。
这篇文章总的来说思路是比较顺畅的，但是在中间，突然使用了DAC，也就是抑制DNMT抑制剂进行DNA甲基化的抑制，似乎还缺少了一些前期的预测分析。比如在单细胞测序中发现DNMT表达产生差异，或者DNA甲基化相关基因表达产生异常。这样的话可能整篇文章会更顺畅一点，但是从现有的结果，我们也可以看到，即使假设缺少一些潜在的提示，但通过后期的验证也是可以成立的，那么其实假设从何而来也并不是那么重要了。总的来说这篇文章做得还不错，好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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