缺血后肢修复过程中人类CD34+干细胞外泌体的血管形成机制

目的：在本次研究中，我们研究与缺血性损伤后的 CD34+ 细胞治疗相关的 CD34Exo 在促血管生成中的作用；探索缺少细胞或其他旁分泌因子情况下 CD34Exo 的有效性；鉴定 CD34Exo 血管生成和治疗功能的分子基质；并研究体外和体内 CD34Exo 的摄取机制。

图 1 ： CD34Exo 改善 HLI 小鼠的血运重建和功能。

为了评估 CD34Exo 的治疗效果，我们分离和纯化 CD34Exo ，并通过结扎股动脉创建了 HIL 小鼠模型（缺血后肢模型），分别在缺血肢注射 PBS ， CD34 + 细胞， CD34-CM ， CD34Exo ， CD34 Exo-depleted-CM 或单核细胞外泌体 MNCExo - （图 1A ），用 LDPI 图像观察小鼠肢端血液灌注情况（图 1B ）。

发现用 CD34 + 细胞， CD34-CM 或 CD34Exo 处理后的小鼠组织能改善组织坏死，其组织灌注（图 1C ），肢体运动功能（图 1D ），恢复评分（图 1E ）相对有明显提高，说明能改善 HLI 小鼠的血运重建和功能。

图 2 ：肢体组织微毛细血管密度的定量检测表明用 CD34 + 细胞， CD34Exo 或 CD34-CM 处理的小鼠显着增加（图 2A ， 2B ），表明血管生成增强。

图 3 ： CD34Exo 携带促血管生成 miRNA 。

我们从 CD34Exo 提取蛋白质，人血管生成蛋白进行富集分析，并对已知具有血管生成功能的蛋白质的阵列对比，与 MNCExo 相比，分析表明 CD34Exo 没有显着的富集血管生成蛋白（图 3A ， 3B ）。

MicroRNA 微阵列分析显示， CD34 + 细胞和 CD34Exo 具有很强的相似性，和 MNCs /MNCExo 相比， MiR-126-3p 是 CD34 + 细胞和 CD34Exo 中最丰富的 miRNA 、也是比较后差异最大的 miRNA （图 3C ） 。

图 4 ： CD34Exo 中 miR-126 的缺失导致其血管生成功能丧失，在体外和体内。

此外，与 CD34 + 细胞相比， CD34Exo 中 miR-126 显着丰富（图 4A ）。为了解决 miR-126-3p 是否有助于 CD34Exo 功能，我们敲除（ KD ）其在 CD34 + 细胞中的表达（图 4A ）。和对照处理的 HUVEC 相比，我们观察到 miR-126-KD-Exo 处理的 HUVEC 中血管长度、密度的显着降低（图 4B ）。在体外实验中我们将小鼠缺血后肢用 miR-126-KD-CD34Exo 或对照条件处理（图 4C ）。

和对照组相比， miR-126-KD-Exo 组治疗后缺血后肢具有的下肢灌注（图 4E ），肢体运动功能（图 4F ）和恢复评分（图 4G ）均下降。类似地，在 miR-126-KD-CD34Exo 处理的缺血组中毛细管密度（图 4H ），凝集素阳性细胞测量值（图 4I ）显着降低。这表明敲除 miR-126-3p 能消除 CD34Exo 的血管生成和治疗潜力。

图 5 ： CD34Exo 中 miR-126 的缺失导致血管生成基因不能激活。

在用 PBS ， miR-126-KD ， CD34Exo 或 Scrambled-control-Exo 处理的缺血肢体中，我们在 Scrambledcontrol 检测到显着高水平的 miR-126-3p （图 5A ）。而 pri-miR-126 的水平方面没有差异（图 5B ），表明小鼠肢体 CD34Exo 治疗后在 miR-126-3p 的中没有从头合成。检测血管相关的基因表达，发现 SPRED1 （抑血管）表达显著降低（图 5C ）， VEGF ， ANG1 和 MMP9 等促血管生成 mRNA 的表达增加了几倍（图 5D-F ）。总的来说，这些数据表明 CD34Exo 通过诱导血管发生基因表达从而发挥功能。

图 6 ：体外和体内内皮细胞能摄取和转移 CD34Exo 和外泌体 miRNA 。

为了研究 miRNA 如何通过 CD34Exo 转移，我们用荧光（ Cy3 ）标记 miRNA 并分离含有 Cy3-miR 的外泌体，用 RNA 酶 A 处理消除了非特异性的外来物质后，流式细胞术分析证实 Cy3-miR 包含在 CD34Exo （图 6A ， 6b