今天给大家带来的是2017年3月发表在circulation research上的文章：Angiogenic Mechanisms of Human CD34+ Stem Cell Exosomes in theRepair of Ischemic Hindlimb，即“缺血后肢修复过程中人类CD34+干细胞外泌体的血管形成机制”，IF=11.551。
背景：对于心血管疾病患者，人自体CD34 +干细胞的移植已显示能改善缺血组织灌注和功能，并减少截肢率，人CD34 +细胞移植的益处主要通过增加血管生成发生的。之前的实验中，我们已经发现来源于人类CD34+细胞能旁分泌含有促进血管形成的膜结合的纳米囊泡即外泌体（CD34Exo），并且显示CD34 +细胞分泌的外泌体其形态，大小和形状，表达已知外来蛋白标志物和表面标志物。
目的：在本次研究中，我们研究与缺血性损伤后的CD34+细胞治疗相关的CD34Exo在促血管生成中的作用；探索缺少细胞或其他旁分泌因子情况下CD34Exo的有效性；鉴定CD34Exo血管生成和治疗功能的分子基质；并研究体外和体内CD34Exo的摄取机制。
图1：CD34Exo改善HLI小鼠的血运重建和功能。
为了评估CD34Exo的治疗效果，我们分离和纯化CD34Exo，并通过结扎股动脉创建了HIL小鼠模型（缺血后肢模型），分别在缺血肢注射PBS，CD34 +细胞，CD34-CM，CD34Exo，CD34 Exo-depleted-CM或单核细胞外泌体MNCExo -（图1A），用LDPI图像观察小鼠肢端血液灌注情况（图1B）。
发现用CD34 +细胞，CD34-CM或CD34Exo处理后的小鼠组织能改善组织坏死，其组织灌注（图1C），肢体运动功能（图1D），恢复评分（图1E）相对有明显提高，说明能改善HLI小鼠的血运重建和功能。
图2：肢体组织微毛细血管密度的定量检测表明用CD34 +细胞，CD34Exo或CD34-CM处理的小鼠显着增加（图2A，2B），表明血管生成增强。
图3：CD34Exo携带促血管生成miRNA。
我们从CD34Exo提取蛋白质，人血管生成蛋白进行富集分析，并对已知具有血管生成功能的蛋白质的阵列对比，与MNCExo相比，分析表明CD34Exo没有显着的富集血管生成蛋白（图3A，3B）。
MicroRNA微阵列分析显示，CD34 +细胞和CD34Exo具有很强的相似性，和MNCs /MNCExo相比，MiR-126-3p是CD34 +细胞和CD34Exo中最丰富的miRNA、也是比较后差异最大的miRNA（图3C）。
图4：CD34Exo中miR-126的缺失导致其血管生成功能丧失，在体外和体内。
此外，与CD34 +细胞相比，CD34Exo中miR-126显着丰富（图4A）。为了解决miR-126-3p是否有助于CD34Exo功能，我们敲除（KD）其在CD34 +细胞中的表达（图4A）。和对照处理的HUVEC相比，我们观察到miR-126-KD-Exo处理的HUVEC中血管长度、密度的显着降低（图4B）。在体外实验中我们将小鼠缺血后肢用miR-126-KD-CD34Exo或对照条件处理（图4C）。
和对照组相比，miR-126-KD-Exo组治疗后缺血后肢具有的下肢灌注（图4E），肢体运动功能（图4F）和恢复评分（图4G）均下降。类似地，在miR-126-KD-CD34Exo处理的缺血组中毛细管密度（图4H），凝集素阳性细胞测量值（图4I）显着降低。这表明敲除miR-126-3p能消除CD34Exo的血管生成和治疗潜力。
图5：CD34Exo中miR-126的缺失导致血管生成基因不能激活。
在用PBS，miR-126-KD，CD34Exo或Scrambled-control-Exo处理的缺血肢体中，我们在Scrambledcontrol检测到显着高水平的miR-126-3p（图5A）。而pri-miR-126的水平方面没有差异（图5B），表明小鼠肢体CD34Exo治疗后在miR-126-3p的中没有从头合成。检测血管相关的基因表达，发现SPRED1（抑血管）表达显著降低（图5C），VEGF，ANG1和MMP9等促血管生成mRNA的表达增加了几倍（图5D-F）。总的来说，这些数据表明CD34Exo通过诱导血管发生基因表达从而发挥功能。
图6：体外和体内内皮细胞能摄取和转移CD34Exo和外泌体miRNA。
为了研究miRNA如何通过CD34Exo转移，我们用荧光（Cy3）标记miRNA并分离含有Cy3-miR的外泌体，用RNA酶A处理消除了非特异性的外来物质后，流式细胞术分析证实Cy3-miR包含在CD34Exo（图6A，6b）中。接下来我们用Cy3-miR-CD34Exo处理HUVEC，活聚焦显微镜在Cy3-miR-CD34Exo的HUVEC中显示Cy3阳性点状细胞溶质囊泡的存在（图6C）。
为了研究缺血后肢在体内如何摄取CD34Exo，我们使用PE-CD34Exo分离自罗丹明-PE标记的CD34 +细胞的CM并进行处理，流式细胞术分析证实内皮细胞与平滑肌细胞和成纤维细胞相比（图6D，6E），更能最有效地吸收了PE-CD34Exo，以上说明内皮细胞能摄取和转移CD34Exo和外泌体miRNA。
图7：CD34Exo诱导内皮细胞增殖。
缺血后后肢注射R-PE-CD34Exo后12h的共焦图像，观察摄取了PE-CD34外泌体的凝集素阳性内皮细胞（图7A）。吸收CD34Exo的阳性内皮细胞比对照PBS显示不同的散射性质，（图7B）表明CD34Exo可能诱导内皮细胞细胞周期变化，进一步分析发现细胞周期蛋白A和细胞周期蛋白B mRNA表达显著增加。
本文中，作者的结果确定了CD34Exo作为人CD34 +干细胞的旁分泌一员，是关键治疗成分。作者展示了一种新颖的机制，通过它，无细胞CD34Exo通过有益的促血管生成介导缺血组织修复。因此，CD34细胞的功能主要通过在缺血组织中的内皮细胞摄取CD34Exo介导的miR-126-3p转移来诱导功能恢复的治疗。我们可以使用这种新知识改进现有治疗方法，并开发可能有益于与血管疾病患者的替代治疗方法。
