Mol Plant丨基因编辑超级解码工具：SuperDecode！——华南农大联合多家单位开发基因编辑突变分析工具箱

刘耀光/谢先荣研究团队前期开发了一套基因编辑突变分析的在线工具DSDecode（Liu et al., 2015; Xie et al., 2017），可以对包含突变靶点的PCR产物测序所获得的峰图文件中直接从重叠的波峰分析出具体的等位突变序列。另外，也有报道基于二代测序混合文库高通量分析基因编辑突变的网络版分析工具如Hi-TOM（Liu et al., 2019）和网络版与本地版CrisprStitch（Han et al., 2024）。然而，在具体的应用过程中，这些工具仍存在一定的局限性。例如，Sanger测序主要适用于二倍体中检测简单的插入/缺失突变，不能检测嵌合突变、低频或复杂类型的突变，且受到通量低的限制，使用Sanger测序对大规模样本检测的成本较高。基于二代测序的突变检测技术提高了样本突变检测的通量，低频率突变和复杂突变的检测能力也高于Sanger测序，但是由于读长短的特点，对基因组大片段的插入、删除以及特定区域内的多靶点编辑引起的结构变异，不能使用二代测序技术进行检测。此外，由于编辑 样品的二代测序数据量往往很大，在使用网络版工具通过网络传输大数据时经常遇到不通畅、费时的情况。而使用本地版软件工具可避免大数据传输和数据安全性等问题。

为满足科研人员在不同应用场景下的数据分析需求，实现对基因编辑材料的有效和快速鉴定，该团队和合作单位研究人员开发了一款超级解码软件工具箱SuperDecode，包括电脑本地版和在线网络版。SuperDecode可以实现对利用不同测序平台产生的测序数据进行高效分析，并且优化了基于PCR的多样本混合测序文库构建方法，可实现高通量高效数据分析，从而满足科研人员对不同样本通量、不同突变类型鉴定的需求。

SuperDecode包含3个子软件模块：DSDecodeMS、HiDecode以及LaDecode，分别对应Sanger测序、二代测序结果以及三代测序数据的解码分析。其中，DSDecodeMS是研究团队此前开发的网页版工具DSDecod/DSDecodeM（Liu et al., 2015; Xie et al., 2017）的升级本地版，添加了去除Sanger测序两端低质量序列的功能，具有更快的分析速度和更为友好的使用界面，可直接读取靶点扩增子的Sanger测序峰图，分析样本的突变类型。HiDecode能对添加特定barcode序列的多样本混合文库的二代测序文件进行自动拆分和突变解码，实现对多种类型样本的高通量分析，包括二倍体、多倍体、细胞系等。HiDecode还提供了96 × n种特异性barcode序列，理论上可一次性检测多达9,216 (96 × 96)个样本的突变类型。LaDecode则是基于第三代单分子测序技术，对包含多个靶点的目的区域进行PCR扩增，并通过添加barcode的方式建立混合文库进行测序和分析。利用三代测序技术读长较长的优势，LaDecode能够识别目的区域中的各种复杂的突变（如靶点之间的片段替换或插入等），并区分检测样本的所有单倍型。因此，该工具特别适用于分析特定区域内进行多靶点编辑（如启动子平铺删除、饱和突变等）引起的复杂变异。该论文提供了利用各模块分析不同基因组编辑样品的示列。