冷冻电镜中的直接电子探测技术解读

1 冷冻电镜与探测器

本文 讨论的直接电子探测器，其主要应用于单颗粒电子显微镜（ SPEM ）或冷冻电镜（ cryo-EM ），用于观察冷冻水合生物样品。这是一项无需晶体，就能从大量单个分子图像中获取生物大分子高分辨率（近原子级）结构的技术。

冷冻电镜的现代形式起源于 20 世纪 80 年代，由 Jacques Dubochet 开发的在非晶态冰薄膜中快速冷冻单颗粒的方法。单颗粒图像处理程序最初应用于负染样品，随后经过改进，用于冷冻水合样品的图像处理。在直接电子探测器出现前，冷冻电镜主要依靠照相胶片获取病毒等相对较大的大分子组装体的高分辨率结构。

新开发的直接探测器及其相关的数据采集新方法，不仅能够产生更高分辨率的结构，而且所需的单颗粒数量更少。它们还可用于分析一系列此前无法研究的较小分子量的分子结构。

SPEM 是一种获取玻璃态冰薄层中冷冻的单个分子图像的技术，这些分子的结构接近天然状态。由于构成分子的碳、氮、氧和氢原子散射较弱，加上辐射损伤限制了电子剂量，单个分子的图像对比度差，信噪比较低。提取高分辨率信息需要对数万张（甚至更多）单个图像进行对齐和平均。具有高对称性的分子所需图像较少，而分子量较大的分子图像对比度更高，更易于分析。

近年来，利用单颗粒冷冻电镜获得了许多出色的近原子分辨率的大分子复合物结构。 Kühlbrandt （ 2014 ）评论指出，虽然从理论上预期能够达到这种前所未有的分辨率（ Henderson,1995 ），但这一成就依然令人惊喜。尽管更好的软件和更强大的计算能力也为这一成功做出了贡献，但 直接电子探测器的引入显然是最为关键的因素 。基于同样的原因，一旦性能更优的探测器问世，预计还会有进一步的改进。

在过去 30 年中，基于 荧光体 耦合电荷耦合器件（ CCDs ）的电子探测器被应用于冷冻电镜，特别是在二维（ 2D ）电子晶体学中。具有更高探测量子效率（ DQE ）的直接探测器，将改善电子晶体学、断层摄影以及单颗粒冷冻电镜的数据。基于混合探测器技术的直接探测器（如 Medipix2 ），还使得从小型三维（ 3D ）微晶体记录电子衍射数据成为可能。

备注：奈奎斯特频率 (Nyquist frequency) 定义为采样频率的一半，它表示可以无失真重建原始信号所需的最小采样频率。公式： fN = fs/2 （ fN 为奈奎斯特频率， fs 为采样频率）。为避免混叠失真，信号的最高频率必须低于奈奎斯特频率。

在直接电子探测器出现之前发表的一篇关于冷冻电镜获得的高分辨率结构的综述 (Grigorieff & Harrison, 2011) 列出了九种不同的接近原子分辨率的二十面体病毒结构。该综述中选择的单颗粒样品都相当大，范围在 17- 150 MDa 之间，一些具有高对称性，这使得它们的取向确定更容易，因为它们产生的高对比度图像以及随后容易对多个颗粒的数据进行平均。除了一个结构外，所有引用的研究都使用了 照相胶片 ，这在之前被认为是具有最高 DQE 的最佳记录介质。

如今，类似的描述最新高分辨率结构的综述，将包括大多数基于直接电子探测器的研究，通常采用背面减薄的互补金属氧化物半导体 (CMOS) 技术。 这种变化存在诸多原因，本文旨在回顾使直接电子探测器在冷冻电镜领域如此具有吸引力的一些特性。

2 探测器：间接式和直接式

“ 间接式 ” 和 “ 直接式 ” 探测器这两个术语的使用，比冷冻电镜探测器的研究早了十多年。最初，它们应用于 X 射线探测领域。直接探测指的是在气体探测器中对 X 射线光子进行探测，这种探测器会将入射光子的能量转换为电子 - 正离子对，随后在多丝正比室中经过放大后记录计数（ Faruqi ， 1991 ）。而间接探测则是指入射光子被 荧光体 或闪烁体吸收的探测器，发出的光随后由摄像管或 CCD 进行探测和记录（ Arndt ， 1986 ）。

在 荧光体 - 光纤耦合 CCD 探测器应用于 X 射线衍射实验之后，基于类似原理的探测器也被开发用于冷冻电镜，然而在 300 keV 的高能条件下，其高空间频率的探测量子效率（ DQE ）被发现比胶片还差。人们认为，对背后物理原因的理解，例如 荧光体 和光纤中的光散射，是导致基于 CCD 的间接探测器 DQE 较低的原因 （ Meyer & Kirkland ， 1998 ） ，这也促使了对直接探测器的研究，以避免在探测前将能量转换为光（ Faruqi & Andrews ， 1997 ）。

冷冻电镜直接 电子 探测的研究与开发大约始于 25 年前，地点是英国剑桥分子生物学医学研究委员会实验室（ MRC-LMB ）（ Faruqi ， 2001 ）。不过，由于所探测的辐射性质不同（是电子而非光子），其设计原理也完全不同。电子的主要探测介质并非气体，而是特殊掺杂的半导体材料（通常是硅）。从信号形成的角度来看，直接探测器中的信号很强，因为入射电子在硅中每沉积 3.6eV 能量，平均就能产生一个电子 - 空穴对。由于 每个入射电子能产生大量的电子 - 空穴对 ，这就使得信噪比很高。

备注： Medipix2 是由欧洲核子研究组织 (CERN) 的科学家团队开发的。 Medipix 这个名字的由来主要基于两个词的组合： Medi: 来自 "Medical"( 医学 ), 因为该设备最初主要针对医学影像应用而开发， pix: 来自 "Pixel"( 像素 ), 反映了其像素探测器的本质特征。虽然现在 Medipix 的应用已经远远超出了医学领域，但这个名字仍被保留下来，成为了这个系列探测器的品牌标识。

最初为光学应用设计的 CMOS 技术单片有源像素传感器（ Monolithic-Active Pixel Sensor ， MAPS ），在 40 和 120keV 能量电子的初步试验中取得了令人鼓舞的成果。在高达 400keV 的电子能量下，也获得了非常理想的结果。 MAPS 带来最大影响的改进包括：（ 1 ）具备处理更大面积和更多像素的能力；（ 2 ）进行辐射硬化处理，使其能够在电镜中长期使用而不降低性能；（ 3 ）对传感器进行 背面减薄 ，从而在所有空间频率下都能获得高 DQE ；（ 4 ）实现快速连续读出，允许以电影模式记录。

许多研究团队利用了直接探测器提供的第四个关键优势，即通过记录同一样品的时间序列图像（电影）来实现剂量分馈的能力。在新探测器不断开发的同时，新型图像处理计算机程序也在同步发展。其中，特别值得关注的是软件包 RELION （ Scheres ， 2012 ），它因成功引入最大似然方法而闻名。 RELION 使用统计方法处理异质样品，还能够更精确地估计单个颗粒的方向，这对于计算改进的结构至关重要。

对于时间不变的结构，单个电影帧图像可以简单相加得到积分图像，但成像过程中存在一个问题，即会出现一些 束诱导的样品移动和辐射损伤 。新的 CMOS 相机能够收集连续图像，计算算法可以单独处理这些图像，在积分前校正样品移动，从而产生更清晰的图像。

高 DQE 带来的更好的信噪比和图像质量，以及快速读出的综合优势，使得以电影模式收集剂量分馈图像成为可能，而这在过去使用间接探测器时是无法实现的。

3 直接电子 探测器 的技术原理

探测器的现代发展，特别是与冷冻电镜相关的直接探测器的发展，是在早期探测器长期实践经验的基础上逐步形成的。这些经验为理解理想的电子探测器提供了理论框架。尽管实现这样的完美探测器在未来仍有很长的路要走， 这里 主要讲述从间接探测器阶段结束至今的发展历程。

一些历史内容已在几年前的文章和综述中有所提及，包括胶片、基于 CCD 的间接探测器、基于 Medipix2 的混合像素探测器以及 CMOS 探测器的早期发展（例如 Faruqi & McMullan, 2011 ）。因此，这里重点讨论基于背面减薄 CMOS 技术的单片有源像素传感器（ MAPS ），实践证明这是实现这一目标最为成功的技术。

3.1 基于 CMOS 技术的 MAPS

MAPS 探测器通常采用重掺杂 p 型硅片制造，在此基础上外延生长 2 至 20 微米的轻掺杂 p 型硅层。这一外延层具有高度有序性，构成了探测器的敏感层。外延层中注入了高掺杂 p 型层和延伸至外延层的高掺杂 n 型阱。 n 型掺杂阱形成 N + 二极管，其间距决定了探测器的像素尺寸 （ 见图 1 ） 。

当入射的高能电子穿过外延层时，会产生低能电子 - 空穴对 。由于外延层高度有序的晶格结构，这些自由载流子具有较长的平均自由程。其中，空穴能够自由扩散到周围层，并最终被重掺杂 p 阱或硅片收集，而低能电子则被上下更高掺杂 p 型层形成的势能梯度限制在外延层中，最终被 N + 二极管收集。

图 1 和图 3 展示了 MAPS 像素的简化横截面图，图 3 呈现了单个像素的简化读出方案。需要指出的是，三晶体管（ 3T ）像素设计只是众多像素设计中的一种，还有其他更为复杂的设计可用于拓展功能和提升性能。

图 1 MAPS 中 3T 像素的典型侧视图。入射电子在其轨迹上留下一串电子 - 空穴对。在外延层内产生的电子具有足够长的平均自由程，可以扩散到埋置在 P+ 阱中的 N+ 二极管，这个过程受到 P 型和 N+ 型硅不同掺杂浓度所产生的轻微电位差的帮助。衬底由高掺杂硅构成，作为一个惰性结构，具有快速的电子 - 空穴复合特性，因此在信号产生中仅起边缘作用 (Turchetta 等， 2001) 。

图 2 显示了 3T CMOS 探测器中单个像素的简化读出电路。如 图 1 所示，入射电子产生电子 - 空穴对，电子主要在外延层内产生，但只有电子漂移到 n+ 二极管，形成信号。在事件发生前，通过开启晶体管 T1 对节点 A 处的杂散电容进行充电， 事件产生的电子使该电容放电，放电量与二极管收集的电荷量成正比 。像素的电荷在行选择晶体管 T2 和列选择晶体管 T3 的帮助下读出到外部模数转换器，用于形成图像 (Faruqi ， 2007) 。

在 3-T MAPS 探测器中，在上部 p 型掺杂层中制作了 三个 NMOS 晶体管 。其中一个晶体管用作复位，用于在 N+ 二极管上设定固定的初始反向偏置电压。反向偏置的 N + 二极管如同电容器，会被外延层中足够靠近并被捕获的任何电子激发而放电。第二个晶体管配置为源极跟随器，将 N+ 二极管上的电压传输给第三个晶体管，而第三个晶体管则用于选择特定的 N + 二极管电压进行读出。

图 3 单个电子穿过像素的蒙特卡罗模拟，该电子在硅基底中发生背散射。

A ：钝化层 + 互连层； B ：外延层； C ：基底。电子通过时在轨迹上产生电子 - 空穴对，在外延层中产生的电子扩散到收集二极管。在背散射电子轨迹的末端，由于电子能量大大降低，产生了更高浓度的电子 - 空穴对，这导致了更强的信号，而且信号位置也是错误的（ McMullan et al., 2009 ）。

施加到晶体管以及从晶体管读出的电压，通过嵌入在 P 型掺杂层顶部非导电氧化物层中的金属互连，传输至特定像素。最后，整个探测器覆盖一层钝化层，该钝化层由 二氧化硅和 / 或氮化硅 组成，厚度为几微米，具体数值取决于工艺技术。

CMOS 探测器最基本的读出方案之一，如图 2 所示（ Faruqi, 2007 ），在所谓的卷帘快门模式下，复位电压依次顺序施加到每行 N + 二极管。复位后，各个二极管电压的变化反映了在给定二极管附近外延层中产生的电荷量，此电荷量与入射电子数量成正比。在固定时间后，给定行中二极管的电压被读出，并在芯片上或外部的模数转换器中进行数字化。 卷帘快门模式本质上是并行的，能够实现高速读出，这对于电影模式成像至关重要 。对于辐射敏感样品的成像，尤其是电影模式成像，最大化信噪比至关重要。

3.2 背散射对 CMOS 探测器性能的影响

单个电子穿过传感器的外延层时会沉积少量能量，通常每微米硅产生约 80 个电子 - 空穴对。由于相互作用具有随机性，沉积的能量量会有所变化，某些事件贡献的能量远高于平均值。正如 McMullan （ 2011 ）所指出的， 300 keV 电子的行为会带来一些问题。任何穿过外延层和衬底的电子都会留下幅度和位置明确的信号。然而， 来自衬底的背散射电子可能在初始撞击点一定距离处产生信号 。

图 3 展示了背散射事件的模拟。由于背散射电子在硅中传播的距离更长，它们已损失能量，所以能够 在第二次穿过外延层时沉积更多能量，产生比原始穿越更大的信号 。由于背散射事件增加了事件的总体信号，零空间频率下的 DQE 相对保持不变，甚至略有提高。然而，较高空间频率下的 DQE 降低，因为背散射的贡献降低了分辨率，并为事件 增加了额外的高频噪声 。

另一个关于 300 keV 电子在硅中行为的蒙特卡罗模拟（如图 4 所示），说明了背散射导致 DQE 降低的原因。模拟中选择的硅总厚度为 350 微米，与典型传感器的厚度相似，而顶层为 35 微米。电子轨迹贡献 “ 有效 ” 信号，而背散射电子降低了高空间频率下的 DQE 。 背面减薄或移除传感器的浅灰色部分的好处在于，消除了大部分背散射轨迹（白色显示） 。

图 4 蒙特卡洛模拟呈现了 300 keV 的电子穿过厚度为 350 微米的硅传感器时的轨迹，其中传感器顶部 35 微米 （ 深灰色 ） 。入射电子以黑色呈现，白色轨迹所显示的是在撞击位置之外产生信号的背散射电子，这些背散射电子会降低高空间频率下的 DQE （ McMullan ， 2009 ）。此模拟表明，厚度为 35 微米的背面减薄传感器应具备更优的 DQE ，这一结论已得到实验证实。

3.3 探测器 使用过程中的辐射损伤

与 CCD 探测器，或者混合像素探测器中的辐射敏感电子层不同， CMOS 探测器直接暴露于电子束之下，这使得它们更易遭受辐射损伤（ Faruqi ， 2005 ）。

在冷冻电镜实验所关注的能量范围（即最高达 300keV ）内，探测器所受的辐射损伤几乎完全由电离损伤造成，这取决于 入射 电子在传感器中沉积的总能量。在这些能量条件下，硅原子获得足够能量而被击出规则晶格的位移损伤概率极小（ Bogaerts ， 2003 ）。电离的主要影响是使 传感器的暗电流或漏电流增大 。暗电流增大的主要后果是， 随着剂量增加，传感器的动态范围减小