原名： Metabolomics combined with biochemical analyses revealed phenolic profiles and antioxidant properties of rapeseeds

译名： 代谢组学结合生化分析揭示了油菜籽的酚类物质和抗氧化特性

期刊： Food Chemistry

IF： 8.5

发表时间： 2024.11

通讯作者： 魏芳

通讯作者单位： 中国农业科学院油料作物研究所

油菜籽中酚类化合物的非靶向分析程序如图1所示。经过预处理（包括去除杂质、冻干和粉碎）后，我们采用两步提取法从油菜籽中提取酚类化合物。首先，用甲醇提取酚类化合物。然后用DES（葡萄糖-尿素，1:2）提取剩余沉淀。提取物用固相萃取柱纯化，所得溶液与甲醇提取物合并。合并后的提取物在氮气下干燥，并重新溶解于甲醇中，用于UPLC-QTOF-MS/MS分析。分析结束后，我们将结果导入PeakView软件，以评估该方法的稳定性和准确性。通过比较油菜籽提取物的MS/MS图谱与GNPS、MassBank、ReSpect、Fiehn和HMDB等数据库中的图谱，我们对酚类化合物进行了鉴定；通过比较不同酚类化合物在MS/MS图谱中的碎片模式，得出了它们之间的相关数据。油菜籽中酚类化合物结构的进一步注释是通过Cytoscape软件对MN的可视化实现的。

油菜籽提取物的总离子色谱（TIC）由PeakView软件生成。质控样品的TIC图谱见图S1。质控样品总离子色谱图的一致性表明仪器和方法是可靠的，可用于比较各种油菜籽样品中的酚类化合物。

图2A显示了油菜籽中酚类化合物质谱片段与数据库中酚类化合物质谱片段的比较。图2A(a-f)显示了山柰酚、桃金娘素、氰苷、山奈苷、西伯利亚糖A6和鹅掌楸素的匹配结果。蓝色部分表示油菜籽中酚类化合物的质谱信息，红色部分表示数据库中的质谱信息。横轴表示m/z，纵轴表示碎片的相对丰度。在图2A(a)中，化合物（a）的分子离子[M+H] ⁺ 的m/z为287.0555，与数据库中山奈酚[M+H] ⁺ 的m/z（287.055）非常吻合。其碎片离子（213.0548、153.0166和68.9975）也与山柰醇的碎片离子（213.055、153.018和68.997）非常吻合，相似度为84.80%，从而确定了其身份。在图2A(b)中，化合物(b)的m/z为465.0994，与桃金娘素（465.103）非常接近，其片段（303.0515和229.0543）与桃金娘素的片段（303.051和229.051）的相似度为86.52 %，确定其为桃金娘素。在图2A(c)中，化合物（c）的m/z值（611.1542）与氰苷（611.161）相匹配。它的片段（449.1076和287.0528）与氰苷（449.108和287.056）匹配，相似度为80.59%。在图2A(d)中，化合物(d)的m/z为310.1653，与山奈苷（310.1649）匹配。化合物（d）的片段（251.0928、207.0665、175.0402、147.0439 和119.0485）与山奈苷的片段（251.092、207.065、175.037、147.039和119.047）吻合，相似度高达97.10 %。在图2A(e)中，化合物(e)的碎片离子[M-H ₂ O+H] ⁺ 的m/z值（531.1707）与西伯利亚糖A6的m/z值（531.1708）非常接近。化合物（e）的片段369.1192和207.0648与西伯利亚糖A6的片段（369.117和207.066）非常相似，相似度高达92.78%。在图2A(f)中，化合物（f）的m/z为781.2379，与鹅掌楸素（781.291）一致。其片段619.1833与鹅掌楸素的片段619.199吻合，相似度高达96.83%，从而确定了其身份。

根据油菜籽中各种酚类化合物质谱片段的相似性，我们确定了它们之间的相关性。我们利用Cytoscape软件构建了相关网络图，以表示油菜籽中不同酚类化合物之间的相互关系。在图2B-C中，每个圆圈代表一种独特的酚类化合物，圆圈内的数字表示其分子离子的m/z。连接圆圈的线表示化合物之间的相关性。连接线越粗表示化合物的质谱碎片越相似，这可能表明化合物的化学结构相似，连接线上的数字表示确切的相似度得分。这有助于将化学结构相似的化合物聚集在MN中。例如槲皮素与山柰酚的相似度为0.76，山柰酚与表皮素的相似度为0.85，表皮素与木犀草素的相似度为0.90，表皮素与桃金娘素的相似度为0.93，表明表皮素与桃金娘素的化学结构相似度最高，其次是表皮素与木犀草素、山柰醇与表皮素、槲皮素与山柰醇。如图2A(a)和(b)所示，槲皮素和木犀草素是通过酚类标准进行鉴定的，而山奈酚和桃金娘则是通过将其质谱与数据库进行比较进行鉴定的。此外m/z 449.1043的MS2片段比m/z 465.101的片段减少了16 Da，表明羟基消失了。与m/z 449.1043处的片段相比，m/z 287.0550处的MS2片段减少了162Da，这表明失去了一个葡萄糖单元。化合物449.1074和287.0559在m/z 153处具有相同的MS2片段，表明它们具有相似的A环结构。因此根据与化合物465.101和287.0559的相似性得分，化合物449.1074可被初步确定为理想素。

油菜籽提取物中共鉴定出117种酚类化合物，包括36种黄酮类化合物、23种香豆素类化合物、12种酚酸类化合物、10种木质素类化合物、4种芪类化合物、4种二芳基庚烷类化合物、1种单宁酸类化合物以及其他几种酚类化合物。除一些常见的酚类化合物外，如芥子碱、芥子酸、水杨酸、阿魏酸、香豆素、3-羟基苯甲醛、木犀草素、山奈酚、丁香酸、槲皮素、莨菪酮、黄芪苷、东莨菪素、当归内酯、4-甲基伞形酮、2′-羟基染料木素和木犀草素-7-葡萄糖苷也有文献报道。本研究中检测到的大多数酚类化合物尚未被报道存在于油菜籽中。因此，本研究首次报道了油菜籽中的许多酚类化合物。鉴定出的酚类化合物的名称、分子式、加合物、保留时间、m/z、信噪比（S/N）、二级质谱片段等详细信息见表S1。从表中可以看出，所有鉴定出的酚类化合物的理论m/z值与实验m/z值的绝对误差均小于50 ppm，说明鉴定结果可靠。

酚类化合物是植物中广泛存在的一类次生代谢物，主要通过苯丙类代谢途径产生。油菜籽中酚类化合物的产生受多种因素的影响，其中遗传背景的差异已被证明会影响油菜籽中酚类化合物的积累。图3A中的饼状图显示了三种油菜籽基因型中酚类化合物的相对含量。图中红色、黄色和蓝色部分分别对应于甘蓝型油菜籽（ B. napus ）、白菜型油菜籽（ B. rapa ）和 芥菜型 油菜籽（ B. juncea ）中酚类化合物的百分比含量。结果表明，阿魏酸衍生物A、氰苷、二甲基鹅掌楸脂醇B、乙酰黄豆苷、山奈酸、黄芪苷、鼠李素3-槐糖苷、木犀草素-7-葡萄糖苷、丁香酸和马齿苋醇等21种酚类化合物的相对含量在甘蓝型油菜籽中最高，其次是白菜型油菜籽和 芥菜型油 菜籽。黄酮3-O-糖苷A、异黄酮衍生物A、木质素糖苷A、亚麻苷、氯苷酸甲酯、莨菪酮、山奈酸、4-阿魏酰奎宁酸、福美双和对香豆酸衍生物A等18种酚类化合物的含量在甘蓝型油菜籽中最高，其次是 芥菜型油菜籽 ，而在白菜型油菜籽中含量最低。结果表明，叶黄素、异黄酮衍生物B、紫檀芪、咖啡酸衍生物B、没食子酸衍生物A、大叶黄素、2′-羟基染料木素、黄酮类化合物7-O-糖苷A、鹅掌楸素等16种酚类化合物在白菜型油菜籽含量最高，其次是甘蓝型油菜籽， 芥菜型油菜籽含 量最低。鱼腥草素、二甲基木犀草素、松脂醇二甲醚、异鼠李素3-O-半乳糖苷、木质素苷C、黄酮3-O-苷B、麦角苷、东莨菪素、山奈苷等21种酚类化合物白菜型油菜籽的含量最高，其 次是芥菜型油菜籽 ，而甘蓝型油菜籽的含量最低。结果表明，槲皮素、水杨酸、姜黄素A、桃金娘素、姜酚、连翘苷B、 2-乙酰乳糖苷和脱肠草素等27种酚类化合 物在芥菜型油菜籽中含 量最高，其次是白菜型油菜籽，在甘蓝型油菜籽含量最低。阿魏酸、黄酮C-糖苷A、黄酮O-糖苷A、柠檬酚、香豆素、山柰酚、对香豆素衍生物C、4-辛基苯酚和百里酚等14种酚类化合物 在芥菜型 油菜籽的含量最高，其次是甘蓝型油菜籽，而白菜型油菜籽中的含量最低。这项研究发现，油菜籽中酚类化合物的种类和相对含量受其基因型背景的影响，不同的油菜籽基因型具有独特的酚类化合物特征。这些结果可为油菜品种选育和油菜酚类化合物的挖掘提供有用的数据支持。然而，非靶向代谢组学技术的局限性在于它只能提供油菜籽中酚类化合物的相对含量数据，而非绝对含量数据。因此今后应开发有针对性的代谢组学方法，对这些功能性化合物进行精确定量，帮助鉴定和利用油菜籽中的高含量生物活性化合物。

图4A-D分别显示了不同油菜品种提取物的TPC、TFC和抗氧化活性（DPPH和ABTS ^{+ ⁎} 清除率）。蓝色、黄色和绿色柱形分别代表甘蓝型油菜籽（N）、芥菜型油菜籽（J）和白菜型油菜籽（R）油菜品种，每个基因型有六个品种。红线表示每个基因型的平均值。如图4A所示，甘蓝型油菜籽油菜籽的TPC最高，平均为810 ± 128 mg/100g，明显高于芥菜型油菜籽（630±57 mg/100g）和白菜型油菜籽油菜籽（559± 68 mg/100g）。这一发现与之前的研究一致，他们也发现TPC的顺序是甘蓝型油菜籽 > 芥菜型油菜籽 > 白菜型油菜籽，油菜籽与其他两种油菜籽之间的差异具有统计学意义（P<0.05）。然而，芥菜型油菜籽和白菜型油菜籽之间的差异并不显著。在各品种中，N-1油菜籽的TPC最高（1022±18 mg/100g），其次是N-2（885±18 mg/100g）和N-5（825±27 mg/100g），而R-6油菜籽的TPC最低（441±10 mg/100g）。油菜籽品种间的TPC差异很大，N-1油菜籽最高（1022±18 mg/100g），N-3油菜籽最低（694±53 mg/100g）。相比之下，芥菜型油菜籽 和 白菜型油菜籽 油菜籽品种之间的差异不太明显，芥菜型油菜籽 油菜籽品种的TPC为564-700 mg/100g，白菜型油菜籽油菜籽品种的TPC为441-626 mg/100g。总之不同油菜籽品种的TPC各不相同，甘蓝型油菜籽的平均TPC显著高于芥菜型油菜籽和白菜型油菜籽。

如图4B所示，甘蓝型油菜籽和芥菜型油菜籽油菜籽品种的TFC值普遍较高，平均值分别为636±115 mg/100g和632±41 mg/100g，均高于白菜型油菜籽油菜籽品种（573±98 mg/100g）。甘蓝型油菜籽和白菜型油菜籽油菜籽品种之间的TFC差异很大。例如在甘蓝型油菜籽油菜籽中，N-1的TFC最高（770±25 mg/100g），N-6最低（467±17 mg/100g）。同样，在白菜型油菜籽中，R-3的TFC最高（687±44 mg/100g），而R-2最低（461±51 mg/100g）。相比之下，芥菜型油菜籽油菜品种之间的TFC没有明显差异，TFC在 590-691 mg/100g之间，N-1、N-2、N-5、J-3、R-3和R-4等品种的TFC相对较高，而N-3、N-6、R-1、R-2和R-5的TFC相对较低。在N-4、N-5、J-1、J-2、J-3、J-4、J-5、J-6、R-3、R-4和R-6油菜品种之间，TFC没有明显差异。总体而言，甘蓝型油菜籽和芥菜型油菜籽油菜籽的TFC高于白菜型油菜籽油菜籽，但大多数品种之间差异不大。

图4C显示了不同油菜品种的DPPH自由基清除率。甘蓝型油菜籽和芥菜型油菜籽油菜籽提取物的自由基清除能力明显高于白菜型油菜籽油菜籽。甘蓝型油菜籽、芥菜型油菜籽和白菜型油菜籽油菜籽提取物的平均DPPH清除率分别为64±6%、60±3%和52±7%。不同油菜品种的DPPH清除率存在显著差异。例如在甘蓝型油菜籽中N-1的清除率最高（74±2%），而N-6的清除率最低，为56±3%。在芥菜型油菜籽中，J-2和J-4的清除率最高（64 %），而J-5的清除率最低（57±1%）。在白菜型油菜籽中，R-5的清除率最高（63±1 %），R-2 的清除率最低（44±3%）。一些品种的清除率在60 %到65 %之间，没有明显差异。相关分析后发现，DPPH清除率与TPC之间存在很强的正相关性（大于0.8），表明TPC越高，抗氧化活性越强。

图4D显示了不同油菜品种的阳离子自由基ABTS ^{+ ⁎} 清除率。从图中可以看出，甘蓝型油菜籽油菜籽提取物的清除能力最强，其次是芥菜型油菜籽和白菜型油菜籽，其油菜籽提取物的平均ABTS ^{+ ⁎} 清除率分别为97±4 %、90±3%和85±5%。不同油菜品种的ABTS ^{+ ⁎} 清除率存在差异。例如甘蓝型油菜籽油菜提取物（N-1至N-5）的清除率介于97%和100 %之间，其中N-6的清除率最低为90±1 %。在芥菜型油菜籽中J-2和J-4的清除率最高（92 %），而J-6的清除率最低（85±2%）。在白菜型油菜籽中，R-5的比率最高（93±2%），而R-1、R-2和R-6的比率最低，从79%到84%不等。一些品种的比率介于89%和93%之间，没有明显差异。ABTS ^{+ ⁎} 清除率与TPC呈正相关（0.87），与TFC的正相关性较弱。这也表明TPC越高，抗氧化活性越强。

植物中酚类化合物的抗氧化潜力来自多种化合物的综合作用，而不是单个化合物。油菜籽提取物的抗氧化活性与其酚类化合物含量之间的相关性见图3B。绿色方框表示DPPH和ABTS ^{+ ⁎} 的清除能力，红色圆圈表示TPC和TFC。黄色圆圈表示油菜籽提取物中的各种酚类化合物。连接这些变量的线，红线表示正相关，蓝线表示负相关。线条越粗表示相关性越强，线条上的数字代表相关系数。从图中可以看出，DPPH和ABTS ^{+ ⁎} 清除能力与TPC和TFC呈正相关。具体来说DPPH与TPC的相关系数为0.80，DPPH与TFC的相关系数为0.56，ABTS ^{+ ⁎} 与TPC的相关系数为0.87，ABTS ^{+ ⁎} 与TFC的相关系数为0.51，这表明与TFC相比，TPC对DPPH和ABTS ^{+ ⁎} 的清除能力更强。一些特定化合物包括黄酮3-O糖苷A、对香豆酸衍生物A、阿魏酸衍生物A、7,8-二甲氧基香豆素、山奈酸和4-阿魏酰奎宁酸，与DPPH和ABTS ^{+ ⁎} 清除能力均呈正相关。3-阿魏酰-1-苷元蔗糖仅与DPPH的清除能力呈正相关，而山奈酸、乙酰黄豆苷、奈菲林、金丝桃素、4′-羟基-3′-异戊基苯乙酮、木犀草苷A、橄榄油酸和蒙花苷仅与ABTS ^{+ ⁎} 的清除能力呈正相关。相反叶黄素、柚皮素、木质素糖苷C、鱼腥草素和紫檀芪等化合物与DPPH和ABTS ^{+ ⁎} 清除能力呈负相关。而黄酮衍生物B、酚苷A、氯二苯甲酮、黄酮3-O-糖苷B和7-乙酰氧基香豆素只与ABTS ^{+ ⁎} 清除能力呈负相关。这种负相关并不意味着它们缺乏抗氧化特性，可能是因为它们与提取物中较强的抗氧化剂发生了拮抗作用，从而抑制了整体抗氧化活性。总之类黄酮3-O-糖苷A、氯代甲酸甲酯、对香豆酸衍生物A、阿魏酸衍生物A具有很强的抗氧化活性。这些酚类化合物含量越高，油菜籽的抗氧化能力越强。因此这些酚类化合物具有开发食品用天然抗氧化剂的潜力。此外7,8-二甲氧基香豆素、山奈酸、4-阿魏酰奎宁酸、金丝桃苷、3-阿魏酰-1-苷基蔗糖、4′-羟基-3′-异戊基苯乙酮、木质素糖苷A、橄榄油酸和蒙花苷等酚类化合物具有抗氧化活性，是油菜籽中潜在的抗氧化剂来源。