你好，十九大！中国，加油！看看分子病理领域，未来发展方向！

一、分子病理诊断技术

1.显色原位杂交

显色原位杂交( chromogenicin situ hybridization， CISH) 技术是分子生物学、 组织化学及细胞学相结合产生的一门新兴技术， 是利用核酸分子单链间碱基互补的原理， 将地高辛或生物素标记的外源核酸探针与组织、 细胞或染色体上待测 DNA 或 RNA 互补配对， 结合成双链杂交分子， 通过过氧化物酶或碱性磷酸酶的呈色反应将待测核酸在组织、 细胞或染色体上的位置显示出来。根据探针种类不同可分为 DNA 原位杂交和 RNA 原位杂交。DNA 原位杂交主要用于基因定位、 特异基因( 如病原微生物基因) 检测等; RNA 原位杂交则用于基因表达检测。 原位杂交技术的优点是操作简单，可直接定位组织， 价格低廉， 信号稳定， 储存方便， 可做组织学评价， 是目前应用较多的分子病理技术之一。

2.荧光原位杂交

荧光原位杂交( fluorescence insitu hybridization， FISH) 技术基本原理与显色原位杂交相同， 不同之处在于 FISH 是应用荧光素标记的探针与组织细胞中待测核酸反应形成杂交体， 并采用荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察信号表达。为了同时检测多个靶位，在荧光原位杂交技术的基础上发展起来一种新技术， 即多彩色荧光原位杂交( multicolor fluorescence in situ hybridization，mFISH) 。它用几种不同颜色的荧光素单独或者混合标记的探针进行原位杂交， 能同时检测多个基因，扩大了 FISH 技术的临床应用。FISH 技术目前主要应用于染色体和 DNA 水平上的病理诊断检测。染色体 FISH 主要检测染色体易位、 缺失、 重复、 变异等; DNA FISH 主要是检测基因突变、 扩增、 易位、 缺失。与原位杂交技术相比， FISH 更加安全、 快速， 特异性好、 定位准确。

3. PCR 技术

PCR 技术是一种在生物体细胞外通过酶促合成特异 DNA 或 DNA 片段的方法。其原理是设计特异引物， 在 Taq DNA 聚合酶催化作用下， 经过高温变性、 低温退火和适温延伸 3个步骤反复循环， 对某一特定模板的特定区域进行扩增， 反应结束后应用凝胶电泳或测序等方法分析产物。 因此， 该技术可以直接检测疾病组织、 细胞中是否存在某种病毒 DNA， 同时 PCR技术还是基因突变检测的前期必备技术。

4.荧光定量 PCR

荧光定量 PCR ( real time PCR) 技术是近几年基于普通 PCR 技术发展的一种新技术。它借助荧光信号来检测 PCR产物， 通过荧光染料或荧光标记的特异探针， 对 PCR产物进行标记跟踪， 在扩增过程中， 每经过一次循环， 荧光定量PCR仪就会收集一次荧光信号， 实时检测整个PCR进程。用荧光定量PCR法检测目的基因仅需检测样本是否具有扩增信号即可， 且 PCR反应具有核酸扩增的高效性， 可检测出微小突变。 根据探针标记不同可分为 TaqMan 探针法和 AＲMS 法。

5.基因芯片

基因芯片又称 DNA 芯片或 DNA微阵列。其原理是在固体载体( 硅片、 玻片、 硝酸纤 维素膜) 上按照特定的排列方式集成大量已知DNA / cDNA 片段， 形成 DNA / cDNA 微矩阵。

基因芯片技术是一门新兴的技术， 由于该技术能在一次实验中自动、 快速、 敏感地同时检测数千条序列， 而且获得的序列信息高度特异、 稳定。根据探针类型分为 DNA 芯片和 cDNA 芯片， 前者用于检测基因突变， 实现肿瘤早期诊断、 判断预后及治疗; 后者用于检测基因表达， 对肿瘤进行发现性分类和预 测性分类。

6.DNA测序

应用于分子病理诊断的 DNA 测序技术有直接测序法和焦磷酸测序法。直接测序技术主要是 Sanger 等发明的双脱氧链末端终止法。其原理就是根据核苷酸在某一固定的点开始， 随机在某一个特定的碱基处终止， 产生 A、 T、 C、 G 4 组不同长度的一系列核苷酸， 然后在尿素变性的 PAGE胶上电泳进行检测， 从而获得 DNA 序列 。直接测序法是基因突变检测的“金标准” ， 其优点是结果准确， 重复性好， 可检测整个测序范围内已知和未知突变点; 缺点是步骤多， 耗时长， 灵敏度低， 过程不易控制 ， 在检测已知突变位点方面将逐渐被荧光定量PCＲ 法替代。

二、分子病理临床应用

遗传性疾病的诊断与分型

分子病理诊断在遗传性疾病的诊断和分型方面凸显特长， 通过对患者染色体、 基因的检测进行遗传病筛查和诊断， 并可对家族遗传病的发生进行预测。目前， 国内主要通过染色体核型分析、 荧光原位杂交技术、 荧光定量PCＲ 技术等检测染色体畸形， 辅助进行产前遗传性疾病的筛查。通过 DNA 直接测序、 荧光定量 PCＲ、免疫组化技术等检测相关基因的结构、 表达的变化，辅助进行神经系统、 生殖系统等遗传性疾病的诊断。

感染性疾病病原体的检测

在感染性疾病的临床应用方面， 采用原位杂交、 PCＲ-斑点杂交对人乳头状瘤病毒( HPV) DNA 检测， 采用荧光定量 PCＲ技术检测结核杆菌 DNA， 采用 PCＲ 技术检测各型肝炎病毒 DNA 或 ＲNA， 采用荧光定量 PCＲ 技术检测人类单纯疱疹病毒( HSV) DNA、 肺 SAＲS 病毒 ＲNA感染， 采用原位杂交检测 EB 病毒( EBV) 编码的小ＲNA( EBEＲ) 等， 这些检测已在感染性疾病的诊断及对疗效进行评价方面取得了很好的效果。

肿瘤的病理诊断与临床应用

单独遗传因素造成肿瘤的概率 ＜ 5% 。肿瘤的发生主要是遗传基因和环境因素共同作用的结果，其中遗传基因是内因， 与人体是否具有肿瘤易感基因有关。肿瘤易感基因检测就是针对人体内与肿瘤发生、 发展密切相关的易感基因进行的， 它可以检测出人体内是否存在肿瘤易感基因或家族聚集性的致癌因素， 根据个人情况给出个性化的指导方案。

在肿瘤辅助诊断方面，目前在软组织和骨肿瘤、淋巴造血系统肿瘤及肿瘤的分子分型中应用最为成熟。

基因表达谱研究在肿瘤预后评估方面起着巨大的推动作用， 如乳腺癌 21 基因检测预测早期乳腺癌复发风险及化疗获益情况， 14 基因与肺癌的预后。另外， 诸如外周血循环肿瘤细胞的检测与肿瘤的复发与转移等技术也逐步在国内获得应用。

三、分子病理的发展趋势