转录调控是指以DNA为模板合成RNA的调控。所有的细胞都具有大量的DNA结合蛋白（反式作用因子），这些蛋白质能准确地识别并结合特异的DNA序列（顺式作用元件），在转录水平上起着“开关”的作用。反式作用因子和顺式作用元件之间的相互作用是转录水平基因表达调控的分子基础。研究DNA与蛋白质的相互作用有许多实验方法，
其中DNA Pull-down是体外研究DNA与蛋白互作的有效方法，常用于验证目的基因启动子与转录因子的相互作用，而寻找上游转录因子需要与液相色谱-质谱技术（LC-MS）联用，即DNA Pull-down MS。
DNA Pull-down
首先
在体外制备针对
DNA
目标区域的脱硫生物素标记的特异性
DNA
探针
，该探针可以
与偶联在磁珠上的链霉亲和素结合；细胞核提取物与
DNA
探针孵育，互作蛋白质可以和
DNA
探针特异性结合；利用链霉亲和素磁珠纯化出与目的
DNA
片段结合的蛋白复合体，经过洗涤可以将非特异性结合蛋白质去除；
然后
经洗脱液洗脱，得到目的
DNA
探针
-
蛋白质复合物
；最后，
经过
Western blot
鉴定蛋白质类型，从而判断蛋白是否与
DNA
结合。
而
DNA Pull-down
MS
最后使用质谱技术检测与
DNA
片段结合的猎物蛋白种类和数量。
生物素与链霉亲和素间的作用是目前已知强度最高的非共价作用；其中活化生物素可以在蛋白质交联剂的介导下，与已知的几乎所有生物大分子偶联。因此用生物素标记核酸后，可以纯化出与该核酸结合的各种生物大分子复合物。
1
、融合表达载体构建，农杆菌介导瞬时遗传转化；
2、取样研磨裂解，收集核蛋白；
3、在体外制备针对DNA目标区域的脱硫生物素标记探针；
4、核蛋白与DNA探针孵育；
5、利用链霉亲和素磁珠纯化与靶DNA片段结合的蛋白复合体；
6、Western blot检测。
图1 DNA Pull-down实验流程图。图片来源：伯远生物。
光敏色素（Phytochromes, Phy）和光敏色素作用因子（Phytochromes-interacting factor, PIF）转录因子是控制植物对红光和远红光响应的主要信号模块。低红光与远红光的比被解释为邻近植物的遮荫并诱导细胞伸长，这种现象被称为避荫综合征（SAS）。PAR1及其最接近的同源物PAR2是SAS的负调控因子；它们属于HLH转录因子家族，缺乏DNA结合所需的典型基本结构域，但它们可以通过其他能够结合DNA的转录因子来调节基因的表达，但该机制尚未确定。2012年5月，西北农林科技大学
梁宗锁
课题组在
Molecular Plant
杂志上发表了一篇题为“Interactions between HLH and bHLH Factors Modulate Light-Regulated Plant Development”的研究论文。作者发现光信号稳定了PAR1蛋白，并且PAR1与PIF4相互作用抑制了PIF4介导的基因激活。DNA Pull-down和ChIP实验表明，PAR1在体外和体内抑制了PIF4对DNA的结合。过表达PAR1的转基因株系（
PAR1OX
）对赤霉素（GA）或高温下胚轴伸长不敏感，与
pifq
（
pif1pif3pif4pif5
四重突变体）突变体相似。除了PIF4，PAR1还与PRE1相互作用，PRE1是一种由油菜素内酯（BR）和GA激活的HLH转录因子。
PRE1
的过表达在很大程度上抑制了
PAR1OX
的矮化表型。这些结果表明，PAR1-PRE1和PAR1-PIF4异源二聚体形成了一个复杂的HLH/bHLH网络，在光照和激素的作用下调节细胞伸长和植物发育。
图2 DNA结合实验显示PAR1抑制PIF4对其靶DNA的结合(Hao et al., 2012)。用生物素标记的
PIL1
启动子片段，孵育并拉下利用大肠杆菌表达和纯化的上述蛋白。免疫印迹法分析Input蛋白和Pull-down蛋白。星号表示PIF4-HIS中的非特异性条带。
1、怎么设计DNA Pull-down的探针？
答：DNA Pull-down的探针长度理想区间为20～200bp。设计探针时尽量避免过长或过短，过短结合的蛋白太少，过长会存在大量的非特异性结合，同时还需尽量避免探针存在大量重复结构或高GC含量等。
2、DNA Pull-down是用DNA单链还是双链作为探针？
答：常规是用DNA双链作为探针，不需要考虑正反义链问题。
3、如何设计对照组？
对照组是磁珠beads+蛋白，虽然没有探针，但少量蛋白可以与磁珠相结合，对照组鉴定到的蛋白是非特异性的背景蛋白。
结题标准
：阳性对照有条带（信号）以及阴性对照无条带（信号）。
1、重组载体的注释信息；
2、重组载体的酶切图谱；
3、重组载体的测序结果；
4、重组载体：一份质粒、一份大肠杆菌菌液（25%甘油菌）；
注：上述4点是客户需要构建载体，且客户自身需要才提供。
5、实验原始图片；
6、实验报告。
1、取样研磨裂解，收集核蛋白；
2、在体外制备针对DNA目标区域的脱硫生物素标记探针；
3、核蛋白与DNA探针孵育；
4、利用链霉亲和素磁珠纯化与靶DNA片段结合的蛋白复合体；
5、SDS-PAGE检测猎物蛋白是否被拉下；
6、质谱技术检测与DNA片段结合的猎物蛋白种类和数量。
图2 DNA Pull-down MS流程图。图片来源：伯远生物。
2023年6月，中国农业科学院宋喜悦和曹双河课题组在
Plant Biotechnology Journal
杂志上发表了一篇题为
“Efficient proteome‐wide identification of transcription factors targeting
Glu-1
: A case study for functional validation of TaB3-2A1 in wheat”的研究论文，前期的研究发现顺式调控元件CCRM1-1是决定
GLU-1
在胚乳中特异性高表达的重要调控元件，为寻找其上游的转录因子，作者以开花后第10天的小麦种子为实验对象提取蛋白，通过生物素标记的
CCRM1-1
探针，进行DNA Pull-down实验，捕获的蛋白进行SDS-PAGE分离，酶解后利用LC-MS对结合探针的蛋白进行鉴定。结果筛选出了31个可能与CCRM1-1相互作用的转录因子，从中挑选出TaB3-2A1进行后续的点对点验证实验，发现TaB3-2A1可以结合CCRM1-1，并且抑制其转录活性，本研究为挖掘与顺式作用元件CCRM1-1互作的大量转录因子提供了数据参考。
图3 DNA Pull-down MS技术鉴定与CCRM1-1结合的转录因子(Xie et al., 2023)。（a）SDS-PAGE和银染色显示以CCRM1-1为探针的DNA Pull-down捕获的蛋白质；（b）通过DNA Pull-down MS鉴定的与CCRM1-1结合的蛋白质种类；（c）基于PLACE数据库预测鉴定出的转录因子与CCRM1-1中顺式作用元件结合的基序；（d）基于小麦转录组数据库预测转录因子编码基因的时空表达谱。
1、DNA Pull down MS可以在那些物种里面做？
答：目前我司可提供烟草叶片瞬转，水稻、拟南芥、玉米、小麦原生质体瞬转，或者提供稳转材料，单独筛选可以用野生型组织材料。
2、
DNA pull down-MS需要准备多少样本量？
答：本实验需要保证足够的蛋白浓度才能维持原本存在的DNA-蛋白互作状态，尤其当蛋白丰度较低、相互作用力不强、使用不易提蛋白组织等情况时。因此用于DNA Pull-down MS实验需准备细胞＞10
7
，动物组织＞0.5g，植物组织＞1g，并且须更加注意采集后速冻-80℃保存和避免反复冻融。
3
、质谱什么时候做定量什么时候不定量？
答：根据自己的实验需要来选择，如果要知道两者之间的差异蛋白（如用质谱比较空白对照与目的蛋白过表达之间的差异蛋白来鉴定与目的蛋白相互作用），就需要定量，如果只是想知道所提供的材料里面的蛋白种类就不需要定量。
4、与酵母单杂筛库相比，
DNA Pull-down MS有哪些优缺点？
对于筛选启动子上游的转录因子，相比于酵母单杂筛库，DNA Pull-down MS存在以下优点：
1）不需要构建文库，不需要筛选启动子的核心区域，也不需要考虑启动子是否存在自激活，可以直接用启动子片段作为诱饵进行富集；
2）可以直接提取分离核蛋白，利用启动子与核蛋白直接结合的特点寻找转录因子，避免与细胞质及亚细胞器中很多结构蛋白的结合，数据更聚焦；3）用液相质谱检测，灵敏度比较高，纳克级别的转录因子也可以被检测到。存在如下缺点：1）DNA Pull-down属于体外实验，在体外结合时，DNA探针没办法像体内那样存在各种修饰，例如甲基化修饰，因此与实际结合状态会存在一些差异；
