NC丨中科院李梅与中国医学科学院马小军团队 糖基转移酶SgUGT94-289-3对罗汉果苷的催化选择性机制研究

罗汉果苷是一类次生代谢物，主要存在于罗汉果的果实提取物中，以其高甜度和低热量而闻名。罗汉果苷是从罗汉果中提取的一系列天然甜味剂。这些罗汉果苷被不同程度地糖基化，其中罗汉果苷V（M5）和赛门苷I（SIA）是两种具有高强度甜度的罗汉果苷。SgUGT94-289-3是一种尿苷二磷酸（UDP）依赖性糖基转移酶（UGT），负责M5和SIA的生物合成，通过连续催化罗汉果苷IIe（M2E）和随后的中间体罗汉果苷产物的糖基化。然而，其混杂底物识别和多种催化模式的机制仍不清楚。

罗汉果苷的工业生产目前完全依赖于从成熟的罗汉果果实中提取。然而，果实中较低的含量和提取纯化的复杂度限制了M5/SIA作为甜味剂的应用。随着合成生物学技术的发展，通过合成生物学策略改善罗汉果苷的生产提供了至关重要的见解。然而，高效生产M5和SIA仍然具有挑战性。由于SgUGT94-289-3负责M5和SIA生物合成的大部分罗汉果苷葡萄糖基化步骤，因此了解SgUGT94-289-3的糖受体识别和催化的分子机制至关重要。

图1 代表性罗汉果苷的结构

SgUGT94-289-3的酶学表征

作者首先表达并纯化了SgUGT94-289-3蛋白，并测定了其对参与M5生物合成的各种糖受体（M2E、M3、M3E、M4A、SIA)的特异性。实验结果表明SgUGT94-289-3在很大程度上保持了每种糖受体只产生一种特定产物的优势，除了M4A。此外，SgUGT94-289-3具有β（1-6）葡萄糖基化偏好，且对罗汉果苷的R1端比R2端更有利，因此在反应端和糖苷键的连接上都表现出相对严格的区域选择性。接下来作者进一步将纯化的SgUGT94-289-3与M2E和UPG一起孵育，以验证其在体外一锅法合成M5的能力。结果表明SgUGT94-289-3的催化顺序是从M2E到M3，然后是M4A，最后是M5。

图2 SgUGT94-289-3 对罗汉果苷的催化性能

SgUGT94-289-3 和结合的 UPG 的总体结构

为了研究SgUGT94-289-3的催化机制及其与糖受体/供体的结合方式，作者解析了SgUGT94-289-3的10种晶体结构。结构分析表明，SgUGT94-289-3采用典型的UGT折叠，其N/C-末端结构域（NTD和CTD）分别负责结合糖受体和供体。NTD由7条β-链（Nβ1-7）和10条α-螺旋（Nα1-10）组成，而CTD由6条β-链和9条α-螺旋（Cβ1-6和Cα1-9）组成。这10种晶体结构表现出几乎相同的整体折叠，尤其是它们的CTD，但Nα6-Nα8螺旋的构象略有不同。与其他结构相比，apo、UDP-1和UPG结构中的Nα8螺旋倾斜约30度。这些构象差异可能与其特定的催化性能有关。

图3 SgUGT94-289-3 和结合的糖供体的整体结构

用于SgUGT94-289-3中糖受体结合的口袋2

6个受体结合中，M3和SIA_V148G具有相同的受体结合模式，一个M3/SIA分子结合在位点3，另一个M3/SIA分子位于由Nα6-Nα8区形成的口袋中。后者M3/SIA采用R2-in取向，R2端深入口袋内部，并靠近催化中心，故称该位点为口袋2。两个结构中的M3和SIA分子完美重合，尤其是它们的R2端，在两个受体分子中是完全相同的。口袋2中M3分子R2-G1的6-OH与H22成氢键，表明口袋2中的M3分子处于生产状态，并准备通过β（1-6）键进行糖基化以产生M4A。残基W17、H96和E273与M3分子R2-G1的其他三个羟基相互作用，表明这些残基在口袋2中的糖受体定向和确定SgUGT94-289-3的产物特异性方面发挥了重要作用。这些结果表明SgUGT94-289-3的口袋2能够容纳R2-in方向的糖受体，从而促进其R2-G1基团的β（1-6）糖基化。

图4  SgUGT94-289-3在口袋2中与糖受体的复合物的结构

用于SgUGT94-289-3中糖受体结合的口袋1

接下来，作者分析了M3E结构中的糖受体结合模式，发现除了位点3的一个M3E分子外，另一个M3E占据了一个与口袋2不同的口袋，由Nα4和Nα8组成。后一种M3E分子采用R1-in取向，其R1端指向催化中心，故称该位点为口袋1。为了验证M3E在SgUGT94-289-3中的结合模式，作者使用无三联体的SgUGT94-289-3模型进行了分子动力学（MD）模拟，其中UDP分子被UPG分子取代。作者发现M3E分子在R1-in状态下稳定地结合在口袋1内，并在模拟结束时向UPG分子靠近。R1-G1的6-OH向UPG-Glc移动4.3 Å，并位于与催化残基H22的氢键距离内。此外，作者发现在M3E接近时，UPG-Glc翻转并切换到活性构象。作者将两种糖受体分别对接到SgUGT94-289-3结构中并进行MD模拟。发现两种糖受体都采用R1-in取向，并稳定地结合在口袋1中，类似于M3E。结果表明SgUGT94-289-3中的口袋1在R1-in方向上更好地结合糖受体，这可以在R1-G1基团上进一步进行糖基化。

图5 SgUGT94-289-3在口袋1中与M3E的复合物的结构

一种SgUGT94-289-3催化的双口袋模式

M3E和M3结构表明，尽管位于不同的口袋中，但M3E和M3分子以相似的方式与SgUGT94-289-3相互作用，即通过围绕支架区域的非极性相互作用以及与不同反应末端的额外氢键相互作用。作者进一步叠加这两个结构，发现M3E的R1-G1和M3的R2-G1位于同一活性位点，该位点由SgUGT94289-3中的W17、H22、H96、L123和V373形成。虽然M3E和M3结构中的两种底物具有相似稳定残基，但它们也与酶形成不同的相互作用。为了验证双口袋结构在催化中的功能作用，作者分析了针对参与结合M3E（口袋1）和M3（口袋2）的残基的单点突变的酶活性。这些残基对各种罗汉果苷底物的催化活性和特异性的贡献不同，这与它们在酶上的具体位置一致。对SgUGT94-289-3突变体的酶促实验表明SgUGT94-289-3利用双口袋模式结合和催化罗汉果苷。该酶将R1-in取向的糖受体（M2E、M3E、M4A）结合在口袋1中，而将R2-in状态的糖受体（M3和SIA）结合在口袋2中。不同口袋中糖受体的定向特异性分配可能由罗汉果苷的不对称结构和两个口袋的不同形状决定。结构分析表明，口袋1的开口更宽，口袋2的开口更窄，因此分支的、笨重的R1可以进入更宽的口袋1，而线性的R2端能够进入更窄的口袋2。此外，糖受体可以更容易地进入更宽的口袋1，这可以解释SgUGT94-289-3在催化过程中有利于罗汉果苷的R1端。

图6 SgUGT94-289-3 催化活性和特异性的关键残基

SgUGT94-289-3的连续催化模型

作者根据结构和酶学分析，提出了一个模型来描述SgUGT94-289-3催化的M2E到M5的连续转化，并解释了SgUGT94-289-3对不同罗汉果苷的催化过程中表现出的混杂性和严格的区域选择性。最初，糖受体M2E倾向于进入口袋1，因为它的开口更宽，并采用R1-in方向，从而暴露R1-G1的6-OH。同时，UPG结合到活性位点，准备将UPG-Glc转移给M2E。通过一系列潜在的构象变化，M2E在R1-G1的6-OH处被糖基化，产生主要产物M3。随着M2E的消耗和M3的积累，SgUGT94-289-3利用M3作为其底物。此时，SgUGT94-289-3可能对M3的R1端表现出较低的亲和力，因为其磷酸酶部分可能会对口袋1引入越来越大的空间位阻，而口袋2对其R2端表现出更高的亲和力。因此，SgUGT94-289-3以口袋2中R2-in方向与M3结合，R2-G1的6-OH暴露于催化位点。然后，UPG-Glc通过β（1-6）糖苷键形成转移到M3的R2-G1，产生M4A。M4A随后进入口袋1，将其R1-G1基团定位在催化位点，并转化为M5，同时产生各种额外的副产物。

对β（1-2）葡萄糖基化活性有重要作用的残基

虽然SgUGT94-289-3能够在M2E上进行连续糖基化反应以产生M5，但由于产生大量副产物，这种转化效率很低。为了确定可能增加SgUGT94-289-3区域选择性和活性的潜在位点，作者构建了一系列针对结构中发现的关键结构元件的单突变，产生了70多个突变体。与WT相比，三个突变体V148M、G152A和S185L的M4A产量显著增加。基于上述发现，作者进一步生成了双突变体（V148M/F/W和G152A）。正如预期的那样，双突变体在连续葡萄糖基化系统中表现出M5产量的显著增加，以及积累的副产物的减少。特别是，V148M/G152A突变体表现出最高的M5产量（94%），同时观察到不需要的副产物最少（3%）。类似地，V148F和V148W突变增加了M3到SIA的转换。同样，双突变体V148F/G152A和V148W/G152A表现出SIA产生增加，伴随着M3到M4A转换的减少。SgUGT94-289-3的V148F/G152A和V148W/G152A突变使其末端选择性从R2端变为R1端，并增强了M3的R1端β（1-2）葡萄糖基化活性，从而产生更大量的SIA。

图7 SgUGT94-289-3突变体的催化性质