免疫代谢太热了！国自然思路和方案终于有范文了！

本文解读文献为北京协和医学院杜文静教授团队将于 2024 年 9 月发表在 Molecular Cell （ IF 14.5 ）上的研究： Malic enzyme 2 maintains metabolic state and antitumor immunity of CD8+ T cells ：

一、研究主要发现

研究团队发现苹果酸酶 2 （ ME2 ）缺失导致 CD8+T 细胞的氧化磷酸化受损， ATP 产生减少，三羧酸循环中断导致延胡索酸（富马酸）积累；延胡索酸直接结合到死亡相关蛋白激酶 1 （ DAPK1 ）并与其 ATP 结合位点竞争，从而抑制其活性，从而抑制 mTORC1 通路活性，导致 CD8+T 细胞分泌的颗粒酶 B 、 IFNγ 表达降低，从而抗肿瘤免疫活性降低。

二、研究思路和关键方法

1. T 细胞中敲除 ME2 对抗肿瘤免疫反应的影响如何？

在 ME2 缺失的条件性敲除小鼠模型（ ME2-/- ）接种肿瘤细胞后， 肿瘤生长更快，生存率降低 。 此外， ME2 缺失的小鼠肿瘤中的 CD8+T 细胞数量减少，且这些 T 细胞产生的干扰素 -γ 和颗粒酶 B 降低，增殖能力下降 ， 而对 CD4+T 细胞影响不显著 。

2. ME2 对 CD8+T 细胞抗肿瘤功能是必要的吗？

既然 ME2 缺失影响了 CD8+T 细胞的数量和活性，那么这种影响对 CD8+T 细胞抗肿瘤作用是否是必要的？于是研究团队通过抗体耗竭 CD8+ 或 CD4+T 细胞，结果发现： CD8+T 细胞的 耗竭 消除了 ME2+/+ 和 ME2-/- 小鼠之间在肿瘤大小和存活率上的差异 ， 而 CD4+T 细胞的缺失则没有这种效果。此外，通过 RAG2-/- 小鼠重建实验（ 注 1 ）证明 ME2 对 CD8+T 细胞的抗肿瘤功能具有关键必要作用 。

注 1 ： RAG2-/- 小鼠重建实验 ： RAG2-/- 小鼠由于缺乏 RAG2 基因，不能发育成熟的 B 细胞和 T 细胞。在本研究中，选择 6 至 8 周龄的 RAG2-/- 小鼠，背部皮下注射 MC38 结肠癌细胞建立肿瘤模型，后从 ME2+/+ 或 ME2-/- 小鼠中分离 CD8+T 细胞，并与等量的野生型 CD4+ T 细胞混合，在体外通过抗 CD3 和抗 CD28 抗体激活，得到 ME2+/+ 或 ME2-/- CD8+T 细胞和 CD4+ T 细胞的 T 细胞混合物。在肿瘤细胞接种后 7 天，通过尾静脉将激活的 T 细胞混合物注射到 RAG2-/- 小鼠体内。后观察肿瘤生长和生存率，并分析肿瘤浸润性 T 细胞。

3. ME2 缺失如何抑制 CD8+T 细胞的增殖和效应功能？

通过 Seahorse XF 分析仪测量氧消耗率和 ATP 产生，结果发现： ME2 缺失的 CD8+T 细胞 氧化磷酸化速率降低， ATP 产生和 NADH 水平下降 ；此外，代谢组学分析显示： ME2 缺失导致 TCA 循环中间产物 延胡索酸（富马酸） 、琥珀酸和苹果酸的累积 ，而不影响糖酵解 。

4. 延胡索酸是 ME2 缺失后 CD8+T 细胞活性被抑制的关键代谢物

接下来发现在 TCA 循环的代谢物中， 发现 只有延胡索酸可以抑制 CD8+T 细胞的抗肿瘤作用 ，这里包括了三部分实验：

1 ）对小鼠进行 DMF （一种延胡索酸的衍生物） 处理以增加体内延胡索酸水平，结果显示， DMF 处理增加了 CD8+T 细胞中的延胡索酸水平，并抑制了 CD8+T 细胞的激活和增殖；

2 ）在 ME2 缺失小鼠肿瘤中， DMF 处理促进了肿瘤生长，减少了肿瘤 CD8+T 细胞数量和活化状态，降低 CD8+T 细胞增殖和细胞因子产生能力。

3 ）在 ME2-/- CART 细胞 中过表达 FH 基因（ FH 能够将延胡索酸转化为苹果酸，降低细胞延胡索酸的浓度 ），发现 FH 过表达降低了延胡索酸水平，并恢复了 ME2-/- CART 细胞的激活、增殖和细胞因子产生能力； FH 过表达的 CART 细胞恢复了 ME2-/- CART 细胞的抗肿瘤效果。

5. 延胡索酸抑制 CD8+T 细胞的机制是什么？

既然看到现象了，下面就是考虑机制，即延胡索酸抑制 CD8+T 细胞的机制是什么？

首先，为了确定 延胡索酸的潜在靶点 ，研究团队使用 PharmMapper 服务器预测延胡索酸的潜在结合蛋白，结果 关注到死亡相关蛋白激酶 1 （ DAPK1 ） ；

其次，使用药物亲和反应靶标稳定性（ DARTS ， 注 2 ）和细胞热位移分析（ CETSA ， 注 3 ）实验来 验证延胡索酸与 DAPK1 之间的直接结合 ，结果发现延胡索酸能够保护 DAPK1 免受蛋白酶 K 的降解，并且在热位移实验中观察到 DAPK1 的熔解曲线发生了变化，这表明延胡索酸与 DAPK1 之间存在直接相互作用；再次，通过 DARTS 和 CETSA 实验进一步研究了 延胡索酸与 DAPK1 的特定氨基酸残基（ K42 和 F162 ）的结合 ，点突变实验（ K42A 和 F162A ）表明，这些突变显著降低了 DAPK1 与延胡索酸的结合亲和力，证实了这些残基在延胡索酸结合 DAPK1 中的重要性；

然后，通过体外 ATP 结合实验和表面等离子共振（ SPR ）分析（ 注 4 ）， 研究了延胡索酸与 DAPK1 的 ATP 结合位点的竞争关系 。结果显示，延胡索酸能够 以剂量依赖性方式 减少 ATP 与 DAPK1 的结合，并抑制 DAPK1 的激酶活性。另外，利用 SPR 技术进一步确认了延胡索酸与 DAPK1 之间的竞争性结合，结果发现：在存在延胡索酸的情况下， ATP 无法结合 DAPK1 ，反之亦然，这 表明延胡索酸与 ATP 竞争同一结合位点 。

最后，通过测量 ME2+/+ 和 ME2-/- CD8+T 细胞中 延胡索酸与 ATP 的比值，以及 DAPK1 的激酶活性 ，发现 ME2 缺失导致延胡索酸积累， DAPK1 活性降低；进而研究了 DMF 处理对 DAPK1 活性和 CD8+T 细胞功能的影响，结果发现 DMF 处理降低了 DAPK1 的活性 ，并抑制了 CD8+T 细胞的激活、增殖和细胞因子产生；最后使用 DAPK1 基因敲除小鼠 的实验进一步证实了 DAPK1 在 CD8+T 细胞功能中的必要性。

注 2 ： 药物亲和反应靶标稳定性（ Drug Affinity Responsive Target Stability, DARTS ）实验是一种用于 鉴定小分子化合物与其蛋白质靶标之间直接相互作用的方法 。该技术基于的原理是，如果小分子化合物与其靶标蛋白有高亲和力的结合，那么在蛋白酶消化过程中，这种结合可以保护靶标蛋白不被蛋白酶分解。在本研究中， DARTS 实验被用来验证延胡索酸是否能直接与 DAPK1 蛋白结合，大致方法为：培养细胞过表达 DAPK1 蛋白，收集细胞后进行裂解，将细胞裂解液与不同浓度的延胡索酸孵育，以评估其对 DAPK1 蛋白稳定性的影响；在延胡索酸存在的情况下，加入蛋白酶消化未结合的蛋白；通过加热终止蛋白酶的活性。使用 Western Blot 检测 DAPK1 蛋白的稳定性，通过与对照组（无延胡索酸处理）比较，评估延胡索酸对 DAPK1 蛋白稳定性的影响。

注 3 ： 细胞热位移分析（ Cellular Thermal Shift Assay, CETSA ）是一种用于 检测小分子化合物与蛋白质之间直接相互作用的实验技术 。 CETSA 的原理是小分子与蛋白质结合后，可以增加蛋白质的热稳定性，使得蛋白质在热处理过程中更不容易变性。在本研究中，在这项研究中， CETSA 实验被用来验证延胡索酸是否能与 DAPK1 蛋白直接结合。大致方法为： 293T 细胞转染含有 DAPK1 蛋白的质粒，然后用延胡索酸或其它代谢物处理；将细胞在一定范围内逐渐降低的温度下进行热处理，以测试蛋白质的热稳定性；热处理后，迅速冷却细胞，提取蛋白质，并加入变性剂使蛋白质变性；通过 Western Blot 技术检测 DAPK1 蛋白的稳定性和表达水平。

注 4 ： 表面等离子共振（ Surface Plasmon Resonance, SPR ）是一种 实时监测生物分子相互作用的分析技术 。 SPR 通过测量生物分子结合事件引起的折射率变化来检测分子间的相互作用，这些变化与结合的质量和数量有关。在本研究中， SPR 实验被用来确定延胡索酸与 DAPK1 蛋白之间的直接结合以及它们之间的相互作用特性。大致步骤为：将纯化的 DAPK1 蛋白固定在 SPR 传感器芯片上；将不同浓度的延胡索酸溶液注入流动室，使其流过固定有 DAPK1 蛋白的芯片表面；监测延胡索酸与 DAPK1 结合引起的 SPR 信号变化；根据 SPR 信号随时间的变化，计算延胡索酸与 DAPK1 之间的结合亲和力（ KD ）、结合速率（ kon ）和解离速率（ koff ）；为了进一步验证延胡索酸与 DAPK1 的结合，在存在 ATP （ DAPK1 的内源性配体）的情况下，观察延胡索酸对 ATP 结合 DAPK1 的影响。

6. DAPK1 抑制剂对 ME2 诱导 CD8+T 细胞抗肿瘤的作用。

接下来，使用 DAPK1 的药理学抑制剂 TC-DAPK6 处理 ME2+/+ 和 ME2-/- 的 CD8+T 细胞，结果发现 TC-DAPK6 抑制了 DAPK1 活性，导致 mTORC1 信号通路活性降低；进一步 TC-DAPK6 处理 CD8+T 细胞，结果发现 DAPK1 抑制后 CD8+T 细胞的激活和增殖能力减弱。最后进行体内实验，将经过 TC-DAPK6 处理的 CD8+T 细胞注射到 B16F10 黑色素瘤细胞的 CD45.1 背景的小鼠体内（ 注 5 ），结果显示，抑制 DAPK1 消除了 ME2+/+ 和 ME2-/-CD8+T 细胞在抗肿瘤活性上的差异。

注 5 ： C D45.1 背景的小鼠： CD45 是白细胞共有的表面抗原，其不同的等位基因型（如 CD45.1 和 CD45.2 ） 可以用作遗传标记，帮助区分和追踪不同来源的细胞 。在本研究中，将经过 TC-DAPK6 处理的 CD8+T 细胞注射到接种了 B16F10 黑色素瘤细胞的 CD45.1 背景的小鼠体内，是为了利用 CD45.1 作为遗传标记来追踪和评估这些 T 细胞在肿瘤免疫中的作用，同时 避免与小鼠内源性免疫系统的潜在干扰 。

7. ME2 在 CD8+T 细胞中的抗肿瘤效应依赖于 DAPK1-mTORC1 信号通路。

首先构建了 DAPK1 的构成性激活突变体 CA-DAPK1 （ CA-DAPK1 是一个突变体，不与延胡索酸结合，因此其活性不受延胡索酸的影响 ），进而通过 体外激酶活性实验 ( 注 6 ) ，发现 ME2 缺失不会影响 CA-DAPK1 的活性。

进而在 ME2+/+ 和 ME2-/- CART 细胞中过表达 CA-DAPK1 ，结果发现 CA-DAPK1 的过表达恢复 ME2-/- 细胞中 TSC2 和 S6 的磷酸化水平（ mTORC1 信号通路激活的标志），也恢复了 ME2-/-CD8+T 细胞的效应功能和增殖能力；

最后，将过表达 CA-DAPK1 的 ME2-/-CART 细胞注射到接种了 MC38-MSLN 肿瘤细胞的裸鼠体内，结果发现 CA-DAPK1 的过表达恢复了 ME2-/-CART 细胞的抗肿瘤效果。

注 6 ： 体外激酶活性实验是 一种用于测定激酶活性的实验技术 。这种实验通常在细胞外的环境中进行，允许研究者在控制条件下评估激酶的活性。在这项研究中，体外激酶活性实验被用来评估 DAPK1 （死亡相关蛋白激酶 1 ）的活性，以及延胡索酸对其活性的影响。大致步骤为：纯化 DAPK1 蛋白，并准备其底物，如肌动蛋白结合蛋白（ MBP ）；在包含 DAPK1 、 MBP 、 ATP 和钙调蛋白（ DAPK1 的活性需要钙调蛋白）的反应体系中设置反应条件；在反应体系中添加不同浓度的延胡索酸，以评估其对 DAPK1 激酶活性的影响；通过检测 MBP 的磷酸化水平来定量 DAPK1 的激酶活性。

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