成纤维细胞其实在TME（肿瘤微环境）中，也是一个举足轻重的存在，所以夏老师在PubMed上冲浪的时候，就看到了这么一篇中山大学中山纪念医院发表在48.8分的Cell子刊Cancer Cell上的文章。可以看得出来，这篇文章的工作量是巨大的：
他们研究的是BCa（膀胱癌）的LVI（淋巴血管浸润）和LN（淋巴结）转移，其实他们第一步还是从筛选开始的，首先他们通过单细胞测序，分析了BCa中LVI与LN转移相关的细胞簇（下面的UMAP图相信大家应该能看懂了，这个在《夏老师带你读文献》和《列文虎克读文献》里也都讲过，就是多主成因的降维图形，来分析单细胞测序情况下的不同细胞分簇，每个分簇其实代表了一个转录组相近的一个细胞簇）。结果发现BCa中LVI与LN转移样本中，CAFs（成纤维细胞）变化极大（下图的蓝框），而对CAFs进行再进一步分析后发现BCa中LVI与LN转移组中PDGFRα+ITGA11+的CAFs明显增多：
这也就暗示了，PDGFRα+ITGA11+的CAFs可能与BCa的LVI与LN转移和预后差有关，于是他们进行了预后差异分析，结果发现PDGFRα+ITGA11+的CAFs对应的BCa，的确预后较差（这其实也对应了分子柯霍氏法则中基因的表达与表型的关联性，不清楚柯霍氏法则的话可以看看《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），同时PDGFRα+ITGA11+的CAFs与LECs（淋巴内皮细胞）呈正相关，LECs是淋巴管的关键成分。于是他们用PDGFRα+ITGA11+的CAFs与HLECs（人淋巴内皮细胞）进行共培养，结果的确促进了HLECs的管腔形成：
那么PDGFRα+ITGA11+的CAFs是否是导致BCa的LVI与LN转移的关键呢？于是他们使用了Cre-LoxP特异性敲除了CAFs的PDGFRα和ITGA11（Cre-LoxP系统就是通过Cre重组酶进行特异性细胞基因改造的方法，不清楚Cre-LoxP系统的话，可以去看看《列文虎克读文献》，都给你们介绍过），结果发现，小鼠早期BCa的LVI与LN转移被明显抑制了：
而空间转录组学（其实是根据组织切片上进行转录组学分析，明确空间定位）也确定了PDGFRα+ITGA11+的CAFs是可以和LECs相互作用的：
而PDGFRα+ITGA11+的CAFs是可以和LECs相互作用主要是基于膜接触，那么这个接触的过程激活了什么样的蛋白呢？于是他们进行了GST-Pulldown分析，发现PDGFRα+ITGA11+的CAFs中的ITGA11可以与HLECs上的SELE相互结合。当敲减了PDGFRα+ITGA11+的CAFs中的ITGA11，肿瘤细胞的迁移侵袭也降低了（这个可以说是柯霍氏法则的验证，但实际上这样的敲除法，还是有一定的缺陷的，要知道有什么样的缺陷，可以看看《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）：
ITGA11与SELE相互结合，是可以激活下游通路的，这里他们发现SELE是可以激活Src蛋白的，这个Src蛋白能影响的下游其实就比较复杂了，他们发现SELE与Src结合后是可以激活VEGFR3磷酸化的，通过VEGFR3可以激活下游的MAPK信号通路（其实VEGF信号通路也好，MAPK信号通路也好，这几个信号通路都算是比较常见的，不了解的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列，熟悉一下）。而VEGFR3的磷酸化激活突变体，可以阻断ITGA11与SELE相互结合对于LECs的内皮连接和血管通透性的影响：
其实怎么说呢，Src应该也可也作为是VEGFR的下游，引导PI3K-AKT信号通路（可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的VEGFR信号通路），如果阻断上游的话，下游Src是不是被SELE激活，还有没有价值呢？这段我就有点不太明确了。但是可以知道的是VEGFR3的磷酸化，对于ITGA11与SELE相互结合后激活是必不可少的：
由于PDGFRα+ITGA11+的CAFs影响的是LECs的内皮细胞连接，所以他们也分析了一下PDGFRα+ITGA11+的CAFs的分泌蛋白对于LECs的ECM（细胞外基质）的影响，通过筛选，他们找到了CHI3L1这个分泌蛋白，这个PDGFRα+ITGA11+的CAFs分泌的蛋白，可以通过影响LECs的MMP2重塑LECs的ECM：
然后他们又分析了PDGFRα+ITGA11+的CAFs中PDGFRα和ITGA11转录启动的关键。他们用单细胞测序的伪时间顺序（这个就是按照每个细胞某个基因的表达量，从低到高排列，模拟出一个基因表达的时间顺序），结果发现这个过程中TGFβ信号通路被激活了（TGFβ/SMAD信号也算是个常见的信号通路了，会被胞外TGFβ激活，不熟悉TGFβ/SMAD信号通路的话，可以去翻翻《信号通路是什么鬼？》系列），而激活PDGFRα+ITGA11+的CAFs的TGFβ信号通路的，则是BCa细胞分泌的TGFβ：
最后，他们考虑了对于PDGFRα+ITGA11+的CAFs的治疗。他们使用了两种中和抗体，一个是ITGA11的抗体αITGA11，另一个是PDGFRα+ITGA11+的CAFs分泌的CHI3L1的中和抗体αCHI3L1。结果发现，这两个抗体的确能抑制早期BCa的LVI与LN转移：
最后形成了这样的示意图，PDGFRα+ITGA11+的CAFs通过两种途径影响LECs，一方面是通过ITGA11结合LECs上的SELE，激活Src→VEGFR3→MAPK信号通路；另一方面PDGFRα+ITGA11+的CAFs通过分泌CHI3L1，通过MMP2重塑LECs的ECM：
这篇文章的工作量其实是挺大的，验证过程虽然算不上完美，但是对于ITGA11→SELE→VEGFR3中VEGFR3磷酸化的依赖性上，其实还是可以说明一些问题的。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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