间充质干细胞成骨和成脂分化调控机制研究

1970 年 Friedenstei 首次利用骨髓培养出能够诱导分化为成骨细胞的成纤维样多能细胞 ^{［ 1 ］} ，随后 Martin 于 1981 年在鼠幼胚中分离出类似多能细胞系 ^{［ 2 ］} 。自此陆续有学者从人骨髓、脂肪、脐带血、羊水、胰腺、牙髓等组织分离出干细胞 ^{［ 3-6 ］} 。随着人多能间充质干细胞（ MSCs ）在许多生物医学领域发挥越来越重要的作用，国际细胞治疗学会对 MSCs 提出了通用标准 ^{［ 7-8 ］} ：首先， MSCs 必须具有黏塑性，即 MSCs 能够在标准培养条件下，黏附生长在组织培养瓶上；其次， MSCs 必须能够表达其特异性的表面标志物，包括阳性标志物 CD105 、 CD73 和 CD90 以及阴性标志物 CD45 、 CD34 、 CD14 、 CD11b 、 CD79a 和 HLA-DR ；再次， MSCs 必须具有多能分化潜能，即 MSC 在体外具有向成骨、成脂以及成软骨分化的能力 ^{［ 8 ］} 。这一标准为 MSCs 的临床前以及临床研究提供鉴定依据。诱导成骨的因素常抑制成脂分化，而诱导成脂的因素常抑制成骨分化，因成骨分化和成脂分化相关因子之间的相互作用在 MSCs 细胞分化命运决定中发挥着重要作用，本研究对 MSCs 成骨、成脂分化的信号通路、调控因素进行分析，并对其分化诱导方法以及鉴定方法等进行总结，以期为 MSCs 基础研究及临床应用提供参考依据。

1 MSCs 成骨、成脂分化信号通路

MSCs 作为成骨细胞和脂肪细胞共同的祖细胞，在多种信号调控下，其向成骨、成脂细胞的分化处于一种平衡状态。这些调控都是通过不同的信号通路来激活转录因子进而发挥作用（图 1 ），其中 BMP 、 Wnt 以及 Hippo 等信号通路在 MSCs 分化调控中发挥主要作用。

1.1 BMP 信号通路

骨形态发生蛋白（ bone morphogenetic protein ， BMP ）是转化生长因子 -β （ TGF-β ）超家族中的多功能生长因子 ^{［ 9 ］} 。 BMP 信号通路主要是通过 Smad 和 MAPK 途径触发细胞反应 ^{［ 10 ］} 。 BMP 信号通路通过与 BMP-Ⅰ 和 BMP-Ⅱ 受体结合进而激活 BMP 信号，磷酸化的 Smad1/5/8 与 Smad 4 形成复合物后进入细胞核内并与转录因子结合，以细胞类型特异的方式调节特异性基因的转录 ^{［ 11-12 ］} 。在 BMP 信号激活下，由 Smad 和 MAPK 途径调控 Runx2/Cbfa1 和 PPARγ 基因的表达，而特异性转录因子表达水平的改变则直接影响 MSCs 的成骨、成脂分化能力 ^{［ 13 ］} 。因此 BMP 信号通路在 MSCs 成骨、成脂分化过程中起到双重的调控作用。

1.2 Wnt 信号通路

Wnt 是分泌性糖蛋白家族。 Wnt 信号通路主要是通过典型的 Wnt/β­catenin 和非典型的 Wnt - cGMP/Ca ²⁺ 信号通路来调节 MSCs 向成骨、成脂细胞的分化 ^{［ 14 ］} 。 Wnt 与跨膜受体 FZD 和核心受体 IRP5/6 结合通过抑制 Axin/GSK3/APC 复合物使得 β­catenin 在细胞核内稳定积累 ^{［ 15 ］} 。 β­catenin 与淋巴增强因子结合因子 /T 细胞因子结合能够抑制 PPARγ 基因的表达来抗 MSCs 向成脂细胞分化；通过上调 Runx2/Cbfa1 基因的表达来促进 MSCs 向成骨细胞的分化 ^{［ 16 ］} 。因此 Wnt 信号通路在 MSCs 分化过程中起到了促成骨细胞和抗脂肪细胞生成的重要作用。

1.3 Hippo 信号通路

Hippo 信号由衔接蛋白和抑制激酶组成，并且是果蝇和哺乳动物之间高度保守的信号通路 ^{［ 17-19 ］} 。经典的 Hippo 信号通路是由 MST1/2 和 LATS1/2 激酶与 SAV1 和 MOB1 磷酸化并抑制 YAP 和 TAZ 发挥功能的 ^{［ 20 ］} 。当 LATS1/2 的 PY 基序与 YAP 和 TAZ 的 WW 结构域相互作用时，使得 YAP/TAZ 磷酸化并定位于细胞质内，同时 β-TRCP 依赖性蛋白酶降解； YAP/TAZ 去磷酸化后转移至细胞核内，作为其他转录因子的转录辅激活剂调控细胞的成骨、成脂分化 ^{［ 20-22 ］} 。 Hippo 信号通路通过 TAZ 的 WW 结构域与 RUNX2 的 PY 基序结合上调 RUNX2 、 ALP 以及 Osterix 的表达，从而诱导 MSCs 向成骨细胞分化 ^{［ 23 ］} 。相较于 TAZ 而言， YAP 的作用更为复杂，不但可以作为 RUNX2 的阻遏物，还能够在 YAP 过表达时促进 MSCs 的成骨分化 ^{［ 24-25 ］} 。在成脂分化过程中， Hippo 信号通路在 TAZ 的 WW 结构域与 PPARγ 的 PY 基序结合后，通过抑制 PPARγ 的转录活性从而抑制成脂分化 ^{［ 26 ］} 。而 YAP 则通过诱导 Wnt 拮抗剂来减少成骨信号，进而促进 MSCs 的成脂分化 ^{［ 27 ］} 。

1.4 其他相关信号通路

除上述 BMP 、 Wnt 和 Hippo 信号通路外，还有一些参与 MSCs 分化调控的信号通路。如 Notch 信号通路可通过阻断 PPARγ 和 C/EBPα 的表达来抑制 MSCs 向成脂细胞的分化 ^{［ 28 ］} 。除此之外， Notch 信号通路还可以通过抑制 Wnt/β­catenin 信号通路来降低 MSCs 向成骨细胞的分化 ^{［ 29 ］} 。 Hedgehogs 信号通路通过抑制 PPARγ 和 C/EBPα 的表达及脂质积累来阻止 MSCs 向成脂细胞分化 ^{［ 30 ］} 。同时 Hedgehogs 信号通路通过与 BMP 信号通路相互作用来调控 Smad 进而促进 MSCs 向成骨细胞分化 ^{［ 31 ］} 。其他的信号分子如 FGF 、 IGF 等也参与 MSCs 的分化调控 ^{［ 32 ］} 。值得注意的是这些信号通路在 MSCs 分化过程中并不是单独地发挥作用，而是在特定条件下相互作用共同调控 MSCs 的成骨、成脂分化过程。

2 MSCs 成骨、成脂分化调控

转录因子是各种信号通路的直接或间接靶点，而 RUNX2 、 PPARγ 、 YAP/TAZ 等多个转录因子在 MSCs 向成骨细胞和脂肪细胞的分化过程中起着重要的作用。此外，包括 microRNA 、物理刺激等因素也对 MSCs 的成骨及成脂分化具有重要调控作用。

2.1 RUNX2

Runx2 作为最早的成骨标志物之一，在新骨形成过程中发挥着控制细胞增殖和分化的重要作用 ^{［ 33 ］} 。在成骨细胞分化过程中，目前研究的大多数信号通路都是以 Runx2 为靶点，通过上调 Runx2 促进 MSCs 向未成熟成骨细胞分化，同时抑制其向脂肪细胞的分化 ^{［ 34 ］} 。 Runx2 由 PI 和 PII 启动子启动表达 ^{［ 35 ］} ，并且弱表达于未分化的间充质细胞中，表达上调于前成骨细胞中，在未成熟成骨细胞中达到最高表达水平，而在成熟成骨细胞中表达下调 ^{［ 36 ］} 。 Runx2 与 CBFB 形成的异源二聚体能够增强结合 DNA 的能力和蛋白质的稳定性 ^{［ 37 ］} 。最近有研究表明，蛋白质翻译后修饰能够调节 Runx2 进而调控 MSCs 向成骨、成脂细胞的分化 ^{［ 38 ］} 。

2.2 PPARγ

PPARγ 是促进 MSCs 成脂分化的关键转录因子，其不仅能够调控脂肪生成，同时具有抗骨母细胞生成的作用 ^{［ 39 ］} 。通常所有的前脂肪信号通路都与 PPARγ 相关，并且过表达 PPARγ 能够使成纤维母细胞有效分化为成熟脂肪细胞，而敲除 PPARγ 的研究表明 PPARγ 是体内外脂肪生成所必需的 ^{［ 40 ］} 。此外， C/EBP 能够促进前脂肪细胞的成脂分化 ^{［ 41 ］} 。磷酸化的 C/EBP 诱导 C/EBPβ 激活 PPARγ 和 C/EBPα 转录表达 ^{［ 41 ］} 。而 PPARγ 和 C/EBPα 在整个成脂分化过程中都保持较高水平的表达，并在脂肪细胞的整个生命过程中持续表达 ^{［ 9 ］} 。

2.3 YAP/TAZ

14-3-3 结合蛋白 TAZ 是 YAP 的一个副同源物，是具有 PDZ 结合基序的转录辅激活因子，能够抑制 PPARγ 依赖性基因转录，并且辅激活 Runx2 依赖性基因转录 ^{［ 42-45 ］} 。小鼠的 TAZ SiRNA 转染 C2C12 细胞的研究表明 TAZ 调控 Runx2 刺激的骨钙素基因的表达是成骨细胞分化的重要内源性调节因子；同时也证明了 TAZ 是 PPARγ 诱导基因表达的转录阻遏物，并且是 MSCs 成脂分化程序的内源性抑制剂 ^{［ 26 ］} 。然而 YAP/TAZ 并不是 Hippo 信号通路调节的唯一决定因素，在坚硬的基质上，当 YAP/TAZ 消耗殆尽时 MSCs 成骨分化受到抑制，而在相同基质上敲除 YAP/TAZ 时则促进 MSCs 的成脂分化 ^{［ 25 ］} 。除此之外， YAP/TAZ 还能够与其他的信号通路如 Wnt 、 TGF 、 TNF-α 、 Eph-Ephrin 等相互作用来共同调控 MSCs 的成骨、成脂分化过程 ^{［ 46-50 ］} 。

2.4 其他因素

除上述转录因子之外，成纤维细胞生长因子（ FGFs ）、 miRNAs 和物理因素也能够影响 MSCs 的成骨、成脂分化。 FGFs 是细胞增殖、分化的有效调节因子，而不同 FGF 成员对 MSCs 分化具有不同的调控作用。 FGF7 可通过激活 ERK-Runx2 信号通路刺激干细胞向成骨细胞分化 ^{［ 51 ］} ，而 bFGF 则可通过上调 PPARγ 的水平从而促进成脂分化 ^{［ 52 ］} 。

miRNA 在 MSCs 分化方向中也发挥重要调控作用，不同的 miRNAs 参与 MSCs 分化调节的作用不同，例如 miR204 、 miR211 、 miR637 过表达能够在促进成脂分化的同时抑制成骨细胞的分化 ^{［ 53-54 ］} 。 miR21 不仅能够促进人脐血干细胞的成骨分化，而且可以促进人脂肪来源的干细胞的成脂分化 ^{［ 55 ］} 。 miR138 、 miR335 抑制 MSCs 的成骨、成脂分化 ^{［ 56-57 ］} 。此外，机械信号在 MSCs 的谱系分化中也发挥重要的作用。例如振荡流体流动（ OFF ）能够通过上调 Runx2 、 PPARγ 等的表达来调控 MSCs 的成骨、成脂分化 ^{［ 58 ］} ；动态压迫（ DC ）能够增加骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）中成骨基因的表达进而促进成骨分化 ^{［ 59-60 ］} ；而拉伸应变则能够促进 BMP2 、成骨基因的表达以及钙沉积从而促使 MSCs 向成骨细胞分化 ^{［ 61-63 ］} 。因此，机械信号作为 MSCs 分化的关键调节因素，能够很好地阐明各种物理因素对 MSCs 成骨、成脂分化的调控，进而可以更好地服务于再生医学相关的研究领域。

3 MSCs 成骨、成脂的分化诱导及验证

3.1 MSCs 成骨分化诱导方法

MSCs 向成骨细胞分化过程中转录因子 Runx2 的表达进一步促进 ALP 、 Osterix 、 Col1a1 、 OPN 、 BSP 、 OCN 的表达。这些表达的连续上调将促进成骨细胞成熟和矿化细胞外基质的沉积 ^{［ 64-66 ］} 。在体外培养体系中常用的 MSCs 成骨分化诱导补充剂为 100 nmol/L 地塞米松（ DEX ）、 50 mmol/L 抗坏血酸 -2- 磷酸（ As-2-P ）和 10 mmol/L β- 甘油磷酸（ β-GP ） ^{［ 67 ］} 。 As-2-P 不仅可以促进胶原细胞外基质的形成和成骨细胞相关蛋白的合成，而且能够上调碱性磷酸酶和骨钙素 mRNA 的表达从而促进成骨分化 ^{［ 68 ］} 。 β-GP 是蛋白磷酸酶抑制剂，在基质矿化研究中充当磷酸基团供体，有助于成骨细胞 Ca ²⁺ 的沉积，促进矿化结节的形成 ^{［ 69-70 ］} 。 DEX 是广泛应用的糖皮质激素，在体外诱导成骨分化可提高碱性磷酸酶（ ALP ）活性、骨钙素（ OC ）和骨唾液蛋白（ BSP ）的表达水平 ^{［ 71 ］} 。研究表明， 1 μmol/L 的 DEX 不仅抑制 MSCs 的成骨分化，促进成脂分化。而且能够降低细胞活性，提高活性氧水平，促进细胞凋亡 ^{［ 72 ］} 。

近年来的研究表明除化学药物外，细胞因子、中药及提取物和物理因素等均影响成骨细胞的分化。例如 2 μmol/L 锶能够促进成骨细胞分化和矿化形成，并且抑制脂肪细胞的过度生成 ^{［ 73 ］} 。 H ₂ S 通过 Wnt 信号通路来保护成骨细胞免受 H ₂ O ₂ 或 DEX 诱导的细胞损伤 ^{［ 74 ］} 。生长分化因子 5 （ GDF-5 ）是骨组织工程的一个显著因素，而 DEX/GDF-5 则能增强 ALP 的活性和钙沉积 ^{［ 75 ］} 。类胰岛素一号生长因子（ IGF-1 ）不仅能够促进骨形态发生蛋白 9 （ BMP9 ）诱导的成骨分化，同时通过 PI3K/AKT 途径降低高浓度 DEX 对 BMP9 诱导的成骨分化的抑制作用 ^{［ 76 ］} 。紫草在体外能够诱导 BMSCs 分化为成骨细胞并具有促进其成骨的作用 ^{［ 77 ］} 。低浓度黄芩苷通过调节 OPG 和 RANKL 蛋白的表达来参与骨重塑过程 ^{［ 78 ］} 。 LDI-glycerol-AA-GP-DEX 支架、 HBMSCs laden-LPN-GelMA 支架等均能够支持成骨分化，促进矿化结节的形成 ^{［ 79-80 ］} 。对 MSCs 成骨分化影响因素的深入研究将会为防治糖皮质激素引起的骨质疏松症提供新的方向。

3.2 MSCs 成骨分化验证方法

MSCs 成骨分化的鉴定方法主要包括染色法、成骨特异性转录因子表达以及成骨蛋白质表达的检测等。茜素红、 Von Kossa 是常见的成骨染色方法 ^{［ 81 ］} 。茜素红染色法主要是基于茜素磺酸钠能与 Ca ²⁺ 发生显色反应，产生深红色的带色化合物 ^{［ 82 ］} 。而 Von Kossa 染色法主要是利用硝酸银与钙盐发生反应在强光或紫外下生成金属银，使得钙化组织呈黑色或褐色颗粒 ^{［ 83 ］} 。也可以应用实时荧光定量 PCR （