2016年度最佳技术文章TOP12（CRISPR、测序、自噬测定、染色质分析……）

每年，Cell杂志旗下的“Best of...”系列会评选出主刊和子刊中的最佳研究和综述类文章。截止目前，Cell、Cell Reports、Cell Metabolism、Cell Stem Cell、Cancer Cell、Molecular Cell等10几种期刊均已推出“Best of 2016”合集。

去年年底，曾在《Cell：2016年度最佳文章出炉！（基因编辑、免疫疗法、Zika病毒、冷冻电镜……）》一文中为大家详细回顾了2016年发表在Cell杂志上的最佳论文及综述，涉及的研究方向包括CRISPR、免疫疗法、类器官、阿尔兹海默症、Zika病毒等（见文末）。 

今天，小编要为大家介绍的是Molecular Cell Best of 2016系列。该合集回顾了2016年的一些突出技术进展，包括了2篇Previews、1篇Minireview、1篇Review以及8篇技术论文（Technology Articles）。

该杂志编辑称，2016年，科学家们开发和升级了一些技术来提高研究的速度和便利度。其中，基因组编辑技术CRISPR-Cas9再一次成为焦点。此外，研究人员也开发出了能够更容易、更快分析复杂数据集的新工具。那么，具体究竟有哪些技术入选呢？随小编一起看看吧。

基于CRISPR的新技术

瘤内遗传异质性是肿瘤进化以及适应不同环境的基础。在这一研究中，利用CRISPR/Cas9技术和特殊的DNA条形码（DNA barcodes），研究人员设计了一种用于描述和追踪含感兴趣突变的癌细胞亚群情况的方法。他们利用这一技术模拟了肺癌细胞抵抗EGFR抑制剂的不同机制，并评估了联合治疗的疗效。通过克服当前方法的固有局限，CRISPR-barcoding还可以对大多数类型的遗传修饰进行调查。研究者们认为，CRISPR-barcoding是一种简单且高度灵活的方法，有望极大促进对特定突变的功能研究。

基因组编辑技术CRISPR-Cas9的发展正帮助研究人员以前所未有的精确度和灵敏度来理解基因功能。通过直接纠正致病突变，该技术表现出了治疗遗传疾病的巨大潜能。虽然Cas9酶的脱靶效应一直让人担忧，但向导RNA选择、新酶的发现以及脱靶检测方法等方面的进步正不断改善该技术的特异性。这篇Review回顾了这一领域的重大挑战和突破，汇总了优化CRISPR特异性的关键工具和策略。作者们强调，基因编辑工具的使用者们应该努力建立测定和报告脱靶效应的标准化方法，同时要持续对其特异性进行改进。

DNA甲基化分析技术

2016年7月28日发表的这项研究提出了DNA甲基化分析新技术。具体来说，在这篇文章中，研究人员描述了一种高度敏感的选择性化学标记和捕获方法（nano-hmC-Seal）。利用这一技术，研究人员评估了不同造血分化阶段5-hydroxylmethylcytosine（5hmC）的分布和动力学。利用Nano-hmC-Seal分析纯化的Tet2突变急性髓系白血病（AML）小鼠干细胞，研究人员鉴定出了白血病特异性的羟甲基化区域。研究证实，AML中5hmC模式的改变与差异性基因表达密切相关。总结来说，这一技术为在体内疾病模型和有限的临床样本中研究和检测DNA甲基化动力学提供了一种有效的方法。

结构生物学新技术

许多细胞功能需要多蛋白-DNA复合体的组装。结构生物学的发展旨在描绘这些动态结构。先前技术的一个重要限制是多蛋白复合物中DNA的定位问题。在这一研究中，科学家们将原子力显微镜（atomic force microscopy，AFM）与静电力显微镜（electrostatic force microscopy，EFM）结合，开发了一种能够解决这一问题的、非常灵敏的dual-resonance-frequency-enhanced EFM （DREEM）技术。对核小体和DNA错配修复复合物进行成像发现，DREEM不仅能够揭示DNA缠绕组蛋白的路径，还能揭示DNA穿过单一蛋白和多蛋白复合体的路径。

染色质分析技术

ChIP-seq技术对科学家们认识染色质的结构和功能起了很大的帮助，但也具有一定的局限性。这一研究报告了新的combinatorial-iChIP技术的发展，希望能够改善研究者们对染色质组合复杂性（combinatorial complexity）的理解。

自噬测定技术

巨自噬（Macroautophagy）是一种细胞内的降解系统。这一过程是利用自噬体将胞质成分传递到溶酶体中进行降解。这一研究提出了一种称为GFP-LC3-RFP-LC3DG的荧光探针，用于评估自噬潮（autophagic flux）。利用这一探针，研究人员成功测定了斑马鱼和小鼠胚胎及组织中的自噬潮。研究人员认为，GFP-LC3-RFP-LC3DG探针是一种用于评估培养细胞以及整个生物体自噬潮的简单且定量的方法。

一种测序技术

DNA双链断裂（DNA double-strand breaks，DSBs）会出现在转录、DNA复制以及抗原受体变化的过程中。对DSBs的错误靶向（Mistargeting）或错误处理可能会导致结构的变异和突变。这一研究描述了一种能够在碱基对分辨率下监测DNA末端切除和DSBs的灵敏方法——END-seq。

染色质分析技术

对组蛋白修饰的全基因组分析能够提供对特定细胞类型调控元件和程序的系统了解。然而，传统的ChIP-seq技术并不能捕获组蛋白修饰水平的定量信息，且需要大量的原始材料，样本处理过程也不简便。该研究提出了一种被称为Multiplexed indexed T7 ChIP-seq（Mint-ChIP）的技术来克服这些限制。作者们表示，这一技术能够实现对罕见细胞型、基因型以及药物治疗等条件下的染色质状态动力学的定量研究。

转运蛋白测定技术

跨膜转运蛋白对所有的生命形式都至关重要。然而，转运蛋白目前的测量方法在很多方面都存在不足。这一研究提出了一种被称为Oscillating Stimulus Transporter Assay （OSTA）的技术。由于OSTA能够连续测定转运蛋白的活动，因此能够被用于检测对药物和其它刺激的时间依赖性响应。作者们表示，这一技术有望极大促进转运蛋白功能特异性的研究以及药物的高通量筛选。

这篇Previews主要介绍了一种被称为“proteome-wide approaches”的技术，用于鉴定与RNA交联的肽（the peptides that are crosslinked to RNA）。

这篇Previews主要介绍了可快速、可靠处理Hi-C数据的两种新工具——Juicer和Juicebox。

这篇Minireview主要介绍了用于鉴定活细胞中互相作用的RNA序列的方法。该技术为理解RNA的结构和功能奠定了基础。

来源：生物探索

Cell：2016年度最佳文章出炉！（基因编辑、免疫疗法、Zika病毒、冷冻电镜……）

Mitochondrial Dynamics Controls T Cell Fate through Metabolic Programming

2016年6月9日，来自于Max Planck免疫生物学和表观遗传学研究所的科学家们在《Cell》发文证实，线粒体的形态调控T细胞代谢，从而影响T细胞对抗癌变细胞的能力。线粒体是细胞代谢活动的重要枢纽，负责能量供应。研究发现，激活的效应T细胞拥有分裂的线粒体，而记忆T细胞维持它们的线粒体为融合网状物（Fused Networks）。

更关键的是，研究人员通过药物强制激活T细胞中线粒体的融合，发现激活T细胞产生了记忆T细胞的特征，这类经处理的细胞获得了更长的寿命以及更强的控制肿瘤生长的能力。这意味着，我们可以利用药物靶向线粒体，从而制备出更强大的T细胞用于癌症免疫治疗。（详细）

Genomic and Transcriptomic Features of Response to Anti-PD-1 Therapy in Metastatic Melanoma

2016年3月24日，《Cell》期刊发表一篇文章揭示了PD-1疗法在一些患者身上效果不佳的原因。来自于加利福尼亚大学洛杉矶分校的研究团队试图通过分析治疗前黑色素瘤活组织样本的mutanomes和转录组，鉴定出影响患者对PD-1疗法敏感性或抵抗性的因素。结果发现，整体高突变负荷与改善生存相关，响应PD-1疗法的患者拥有丰富的BRCA2突变。

相反，先天抵抗PD-1疗法的肿瘤则展示了一种转录特征（Transcriptional Signature），其中同时表达上调的基因参与了间充质转化调节、细胞粘附、细胞外基质重塑、血管再生和伤口愈合。该研究成果有助于解析为什么不同的患者对PD-1疗法的响应程度不同。（详细）

Progressive Loss of Function in a Limb Enhancer during Snake Evolution

虽然蛇属于爬行动物，但是几乎所有的蛇都没有脚。但是一亿多年前，蛇原本是有脚的。这种退变是因为什么呢？2016年10月20日，一篇发表在《Cell》期刊的文章揭示了这一进化背后的分子机制。他们证实，蛇肢体形成基因附近的一个增强子区域发生了突变，从而导致蛇足的消失。

至今蟒蛇体内还存在微小的腿骨，这表明它们体内还残存着构建肢体的分子通路。研究人员比较蟒蛇和其他蛇类比如毒蛇和眼镜蛇的基因组，后者体内没有残余的腿骨。结果发现，音猬因子（Sonic hedgehog）基因上游的一段增强子序列存在缺失和突变，从而阻断了该基因的表达，最终导致了蛇足的缺失。当然，研究人员强调，音猬因子增强子的突变只是蛇形态进化的主要原因，还有很多未知值得探索。（详细）

Domestication and Divergence of Saccharomyces cerevisiae Beer Yeasts

家畜、农作物的驯化都有据可查，但是我们对于工业酵母菌株的进化史却知之甚少。2016年9月8日，《Cell》期刊发表一篇文章描述了这些微生物的遗传谱系，特别是啤酒酵母，并由此揭示了酵母首次被驯化的时间、最早的啤酒制造者，以及人类是如何塑造了这个有机体的发展。

来自于比利时鲁汶和VIB大学酵母遗传学家Kevin Verstrepen带领团队对157个用于生产啤酒、葡萄酒、烈酒、清酒、面包，和生物乙醇燃料以及一些用于实验室研究的不同酵母菌株的基因组进行了测序，来探讨这个物种的进化历史。Verstrepen认为：“啤酒的风味主要取决于酵母。我们现在能喝到最好的啤酒，是因为古代的酿造者足够聪明，远在知道他们自己在做什么之前，开始培养酵母。这真的是一门艺术。”（详细）

Zika Virus Infection during Pregnancy in Mice Causes Placental Damage and Fetal Demise

Zika病毒（ZIKV）之所以会成为国际高度关注的突发性公共卫生事件，是因为这一蚊媒病毒可能会导致新生儿小头畸形和格林-巴利综合征（吉兰-巴雷综合征）。为了弄清楚Zika病毒感染的具体机制，华盛顿大学的研究团队于2016年5月19日《Cell》期刊发表文章表明，他们成功构建了被病毒感染的小鼠模型，并证实ZIKV会导致小鼠胎盘损伤和胎儿死亡。

为了绕过小鼠的免疫防御，研究妊娠过程中的病毒传播，研究团队开发了两种小鼠模型：一种是经过遗传学改造，免疫系统有缺陷的母鼠；另一种是注射免疫抑制性抗体的母鼠。他们发现ZIKV更倾向于感染胎盘，且会进一步感染滋养层细胞，损伤胎儿毛细血管。许多感染ZIKV的小鼠胎儿还未出生就夭折了。侥幸活下来的小鼠体型明显更小，大脑和中枢神经系统都有病毒在复制。（详细）

Microbial Reconstitution Reverses Maternal Diet-Induced Social and Synaptic Deficits in Offspring

2016年6月16日，《Cell》期刊新发表一篇文章阐明了母亲孕期高脂肪饮食易导致宝宝出现神经类疾病的原因。来自于贝勒医学院的神经科学副教授Mauro Costa-Mattioli博士带领团队证实，缺少一种特殊的肠道菌株会导致小鼠出现社交缺陷。而且，这种肠道菌群的失衡多与小鼠妈妈怀孕期间摄取高脂肪食物有关联。

他们发现，由高脂肪饮食母亲生下的小鼠，它们体内乳酸杆菌的含量比正常小鼠下降了9倍。当他们认为将乳酸杆菌添加到受影响小鼠的肠道中，能够逆转它们的行为障碍。（详细）

Breaking Cryo-EM Resolution Barriers to Facilitate Drug Discovery

2016年6月16日，来自于美国国家癌症研究所（NCI）的Sriram Subramaniam带领团队在《Cell》期刊发表最新突破：他们使用冷冻电镜（cryo-EM）突破了可视化蛋白质的技术壁垒，成功获得了小于100 kDa的蛋白复合体结构，并使其分辨率突破了2 Å。

研究人员通过单颗粒冷冻电镜解析了异柠檬酸脱氢酶（IDH1，93 kDa）的高分辨率结构，鉴定了小分子抑制剂（ML309）与IDH1结合时的构象改变；同时还报告了乳酸脱氢酶（145 kDa） 和谷氨酸脱氢酶（334 kDa）的结构，分辨率分别达到2.8Å和1.8Å。Subramaniam表示，能够利用cryo-EM在如此高的细节层面上可视化潜在候选药物复合物的结构是非常令人兴奋的。这将加速和改变药物研发的过程。（详细）

Programmable RNA Tracking in Live Cells with CRISPR/Cas9

2016年4月7日，《Cell》期刊发表一篇文章表明，加州大学伯克利分校化学、分子与细胞生物学教授、Howard Hughes医学研究所研究员Jennifer A. Doudna和加州大学圣地亚哥分校教授Gene W. Yeo合作首次利用CRISPR/Cas9体系在活细胞中追踪RNA。

研究团队设计出一种特殊的短核酸PAMmer，促使Cas9能够在不损伤靶分子的情况下有效地识别RNA而非DNA。同时，他们通过荧光标记Cas9，从而实现了对RNA分子的实时监控。（详细）

High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing

如何对内源性蛋白质实现亚细胞定位对于从分子水平解析细胞至关重要。来自于马克斯普朗克佛罗里达神经科学研究所的Ryohei Yasuda团队开发出一种方法——SLENDR（通过CRISPR/Cas9介导的同源指导修复单细胞标记内源性蛋白），能够对哺乳动物大脑单个细胞的内源性蛋白实现高通量、高分辨率的分析。Yasuda表示：“SLENDR将作为一种宝贵的工具，实现蛋白质的亚细胞定位，有助于研究人员确定蛋白质的功能。”（详细）

Ultra-High Resolution 3D Imaging of Whole Cells

2016年8月11日，耶鲁大学的研究团队在《Cell》期刊发表最新研究成果。他们开发出一种新型荧光显微镜，能够以10-20纳米的分辨率揭示细胞内部结构及其蛋白复合体。

继2014年诺贝尔奖化学奖获得者Stefan W. Hell发明的STED和SMSN荧光成像技术突破了衍射限制之后，荧光纳米显微技术或者超高分辨率的显微镜，已经成为细胞生物学研究的重要工具。现在，耶鲁团队开创了4Pi单分子转换纳米显微镜（W-4PiSMSN），进一步提高了整个细胞的成像能力，并在之前的基础上增强了分辨率和定位精度。（详细）

1、CRISPR/Cas9系统的机制和应用

Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature’s Toolbox for Genome Engineering

这一综述由CRISPR“女神”Jennifer Doudna及其团队完成。CRISPR/Cas9系统作用机制分成3个阶段：获得间隔序列、合成CRISPR RNAs、靶向和感染侵入序列。其中，Cas9是由CRISPR RNA和tracrRNA（反式激活crRNA）引导、切割特定DNA序列的核酸酶，它是“魔剪”得以编辑基因的关键酶类。该综述围绕Cas蛋白响应外源核酸多种机制的最新进展进行了讨论，并阐述了在多种物种中这些系统如何被用于精准的基因组操纵。（详细）

The Basis of Oncoimmunology

肿瘤异质性的存在预示着即便是同一种肿瘤，其扩散速度、侵袭能力、治疗效果、预后等方面都会表现出个体差异，而免疫系统的活跃度会影响肿瘤个性化治疗的有效性，改善癌症治疗的效果。A. Karolina Palucka和Lisa M. Coussens围绕肿瘤免疫学的基础，讨论了癌症免疫响应的组成、癌症中慢性炎症和Leukocyte Compartments的改变、基于TH2的抗癌疗法、T细胞免疫靶向治疗、微生物在调节系统癌症风险和响应治疗中的作用以及肿瘤免疫治疗模式等内容。（详细）

Modeling Development and Disease with Organoids

3D细胞培养技术为细胞提供一个更加接近体内生存条件的微环境，让胚胎干细胞以及成体干细胞能够在体外依然保持着自我更新、复制的能力。科学家们以干细胞为材料，通过3D培养技术培育出类似于肾、肺、肠道、大脑、视网膜等器官组织的模型。这些微型器官可以真实模拟人体器官的结合和功能，从而用作疾病模型或者药物筛选平台，甚至于有望成为器官移植的来源。Hans Clevers在综述中表示，类器官开创了再生医学的新窗口，可以与当下热门的基因编辑、基因疗法等技术结合，有着广阔的应用前景。

由多能干细胞培育而来的多种类器官（图片参考：Lancaster and Knoblich, 2014）

The Cellular Phase of Alzheimer’s Disease

20年以来，“淀粉样蛋白假说”一直被认为是阿尔兹海默症（AD）的主要致病机理，它主张β-淀粉样蛋白（Aβ）是导致神经衰亡的直接原因。Bart De Strooper和d Eric Karran围绕神经退化各阶段，从分子生物、细胞病理、临床诊断3个维度探讨了AD病情发展规律，并对大脑星形胶质细胞、小神经胶质细胞和脉管系统长期而复杂的变化过程进行了详细阐述。

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