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通过MSC凋亡小体介导的内源性软骨生成和免疫微环境调节促进软骨修复

BCML速递 · 公众号 · · 2024-10-10 22:32

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近年来，间充质干细胞（ MSC ）移植被广泛认为是治疗糖尿病、自身免疫性疾病、软骨损伤、骨关节炎（ OA ）等疾病的潜在治疗策略。在细胞凋亡过程中，凋亡囊泡（ apoV ），最初称为凋亡小体（ apoBD ）显示出在细胞内分布， ApoV 含有各种生物分子，是重要的生物活动调节器。近期研究表明， apoV 在多种组织器官的免疫应答及组织修复中发挥重要作用。然而， apoV 影响巨噬细胞极化和软骨再生的机制尚未完全阐明。最新研究表明，凋亡的上皮干细胞可促进邻近干细胞的增殖。这一发现表明干细胞在感知凋亡细胞信号后能够重新适应组织稳态和再生需求。然而， apoV 对宿主 MSC 在软骨再生中的影响和机制仍不清楚。分析其如何促进软骨再生的关键分子和通路对于理解干细胞诱导再生的新机制和针对性的治疗策略至关重要。

基于此，来自解放军总医院第四医学中心的郭全义、刘舒云团队和中山大学附属第一医院的郭维民团队使用 apoV 结合脱细胞软骨细胞外基质（ DCM ）支架的无细胞软骨再生策略有效促进了骨软骨缺损的再生。来自人类脐带间充质干细胞（ HUMSC ）的 ApoV 与 DCM 支架结合，通过将富集的 miR-100-5p 和 let-7i-5p 递送至缺损处来增强软骨再生（图 1 ）。

首先，研究者为了确定植入软骨缺损中的干细胞的命运，将装载在 DCM 支架上的 DiO 标记的 HUMSC 植入大鼠软骨缺损模型中。结果表明，许多 MSC 在植入关节腔后不久就会发生凋亡，而产生的 apoV 会被 MSC 和巨噬细胞吞噬，这可能是它们促进软骨缺损修复和再生的潜在机制（图 2 ）

随后，研究者对 apoV 进行了 miRNA 测序，以进一步表征其分子组成。结果显示， apoV 中所含的 miRNA 主要参与干细胞的维持和分化（图 3C ）。其中，与干细胞相关的基因参与了“ Wnt 和 Hippo 信号通路”（图 3E) 。此外，针对巨噬细胞基因的分析表明 apoV 中的 miRNA 主要参与巨噬细胞活化、趋化和分化（图 3D) 。这些发现有助于更好地理解 HUMSC 衍生的 apoV ，为后续的研究提供参考。

鉴于巨噬细胞可在体内吞噬 apoV ，并且参与组织再生和体内稳态平衡。因此，研究者进一步探究了 apoV 的内化是否会诱导巨噬细胞的表型变化。研究者将 DiO 标记的 apoV 添加到培养的骨髓来源的巨噬细胞（ BMDM ）中后，使用共聚焦显微镜观察。结果显示 apoV 以时间依赖性的方式被 BMDM 内化。研究者进一步引入脂多糖（ LPS ）诱导 M1 巨噬细胞作为阳性对照，以确认 apoV 对巨噬细胞表型的影响。结果显示 LPS 诱导的巨噬细胞表达高水平的 M1 相关标志物，而用 apoV 处理的巨噬细胞表达高水平的 M2 相关标志物（图 4B-F ）。这些数据表明 apoV 的内化促进了巨噬细胞的 M2 型极化。

为了进一步研究 apoV 诱导巨噬细胞 M2 极化的分子机制，研究者筛选了 apoV 中最丰富的四个 miRNA ： let-7i-5p 、 miR-143-3p 、 miR-100-5p 和 miR-21-5p 。将小鼠 BMDM 与这四个 miRNA 的模拟物或抑制剂共培养，确定其作用。结果显示 miR-100-5p 模拟物显著上调 CD206 和 Arginase-1 （ M2 ）等基因的表达，同时下调 IL-6 和 iNOS （ M1 ）等基因的表达（图 5B ）。进一步探索发现， miR-100-5p 模拟物显著增加 ERK1/2 的磷酸化（图 5C-D ）。这些研究结果表明 apoV 通过传递 miR-100-5p 促进巨噬细胞的 M2 极化，从而激活 MAPK/ERK 信号通路。

为了研究内化 apoV 对骨髓间充质干细胞（ BMSC ）生物过程的影响，研究者将 BMSC 暴露于不同浓度的 apoV 。将 DiO 标记的 apoV 与 BMSC 共培养后测试其对软骨细胞的影响，结果显示 ApoV 促进 MSC 的增殖和迁移（图 6A-D ）。接着，研究者测试了 apoV 处理的巨噬细胞对 MSC 功能的影响。结果显示 apoV 处理的巨噬细胞显著促进软骨 ECM 相关物质的沉积，提示 apoVs 及 apoV 处理的巨噬细胞有助于 BMSC 向软骨细胞分化（图 6E-G ）。

基于上述结果，研究者推测 let-7i-5p 可能是 apoV 介导的 BMSC 软骨发生分化的关键效应分子。因此，研究者验证并探究了其可能的作用机制。结果显示 eEF2K 是 let-7i-5p 的一个可能靶基因。用 let-7i-5p 刺激后， eEF2K 3 ′ -UTR 的荧光素酶活性减弱，表明 let-7i-5p 与 eEF2K 直接结合。当 eEF2K 的 3 ′ -UTR 发生突变时，这种效应消失（图 7A-C ）。进一步研究表明 let-7i-5p 抑制剂降低了 COL2 、 SOX9 和磷酸化 p38 的表达，显著增加了 eEF2K 的表达（图 7D – F ）。上述结果表明 let-7i-5p 降低了 BMSC 中 eEF2K 的表达和激活，进而促进 p38 MAPK 信号传导以支持软骨分化。

最后，研究者在体内验证了 apoV 对巨噬细胞的极化作用和对软骨生成的作用。结果显示 apoV 在体内能够促进巨噬细胞 M2 极化，调节关节免疫微环境向抗炎和促再生状态发展，为软骨再生和修复提供有利条件（图 8 ）。

综上所述，这项研究揭示了 HUMSC 在软骨缺损中植入后的初始凋亡，并强调了源自 MSC 的 apoV 促进软骨缺损修复的潜力。这些囊泡调节巨噬细胞 M2 极化并增加 MSC 软骨分化，同时抑制炎症并促进软骨再生。从机制上讲， apoV 传递的 miR-100-5p 激活巨噬细胞中的 MAPK/ERK 通路，促进 M2 极化，而 let-7i-5p 靶向 MSC 中的 eEF2K/p38 MAPK 轴以增加软骨分化。在骨软骨缺损大鼠模型中证实了将 apoV 与 DCM 支架相结合的有效性。该研究结果拓宽了对 apoV 在软骨再生中的作用的理解，为治疗关节软骨缺损带来了希望。

本研究由解放军总医院第四医学中心的郭全义、刘舒云研究团队和中山大学附属第一医院的郭维民研究团队合作完成，并于 2024 年 8 月发表于 Bioactive Materials 。

文章信息： Tian G, Yin H, Zheng J, Yu R, Ding Z, Yan Z, Tang Y, Wu J, Ning C, Yuan X, Liao C, Sui X, Zhao Z, Liu S ^* , Guo W ^* , Guo Q ^* . Promotion of osteochondral repair through immune microenvironment regulation and activation of endogenous chondrogenesis via the release of apoptotic vesicles from donor MSCs. Bioactive Materials 2024, 41: 455-470.

供稿：季威

审校：韩凤选

编辑：陈伟成