原名：
LC/MS- and
GC/MS-based metabolomic profiling to determine changes in flavor quality and
bioactive components of
Phlebopus
portentosus
under low-temperature storage
译名：
代谢组学分析低温贮藏暗褐网柄牛肝菌风味品质和生物活性成分的变化
期刊：
Frontiers in
Nutrition
1. 液质联用分析
我们通过LC/MS对代谢物进行鉴定，以确定暗褐网柄牛肝菌在低温储存下的化学成分特征。我们共鉴定出1135种代谢物，正离子模式下有703种，负离子模式下有432种。数据归一化后，我们保留了 1079 种代谢物，包括正离子模式下667 种和负离子模式下412 种，用于后续分析。
在本研究中，我们对菌盖和菌柄代谢物分别进行鉴定，通过 OPLS-DA 对所有数据进行降维，得到的结果表明：菌盖和菌柄中的代谢物在各储存时间点都不同（图 1）。我们对菌盖和菌柄进行了独立分析。
图1 在菌盖和菌柄中鉴定出的代谢物。(A)采收时（第0天）收集的样品。(B)第3天收集的样本。(C)第5天收集的样本。(D) 第7天收集的样本。(E) 第13天收集的样本。
为了评估不同储存时间对暗褐网柄牛肝菌的影响（图2），PCA分析结果显示，储存7天后菌盖和菌柄产生的代谢物有所不同。
图2 低温储存的菌盖(A)和菌柄(B)中样品的PCA 得分图。
2. 不同储存时间的差异代谢物分析
通过 LC/MS 分析，我们在5 组菌盖和菌柄中分别检测到 583 种（补充文件 S1）和 500种（补充文件 S2）不同代谢物。
在超类水平上，菌盖中的583种代谢物主要由198种脂质和类脂分子、77种有机酸及其衍生物、56种有机含氧化合物、41种有机杂环化合物、39种苯丙素和聚酮化合物、24种苯类化合物、19种核苷、核苷酸及类似物、2种生物碱及其衍生物和 1 种有机氮化合物组成（图 3A）。在类和子类水平上（图3B、C），我们分别注释到了 64 和 107 个类和子类。类水平上数量最多的化合物是脂肪酰类（91）、羧酸及其衍生物（66）、有机氧化合物（56）、异丙酚脂类（43）和甘油磷脂（28）。子类水平上数量最多排名前 5 的化合物是氨基酸、肽和类似物 (63)、碳水化合物和碳水化合物结合物 (45)、脂肪酸和结合物 (33)、二十碳烯酸类 (15) 和亚油酸及其衍生物 (14)。
菌柄中的500种不同代谢物被鉴定到10个超类（补充文件S2和图3D），包括脂质和类脂质分子（153）、有机酸及其衍生物（62）、有机杂环化合物（49）、有机氧化合物（45）、苯丙素和聚酮化合物（32）、苯类化合物（23）、核苷和类似物（17）、有机氮化合物（4）、生物碱及其衍生物（3）以及木脂素、新木脂素和相关化合物（1）。菌柄中代谢物分别被注释到62 个类和 104 个子类中（图 3E、F）。
图3 菌盖（583）和菌柄（500）不同储存时间下的差异代谢物的分类和注释。(A) 菌盖的超类。(B) 菌盖的类。(C) 菌盖的子类。(D) 菌柄的超类。(E) 菌柄的类。(F) 菌柄的子类。
3. 不同储藏时间的差异代谢物及其表达分析
根据上述差异代谢物分析，脂类和有机酸的差异代谢物最丰富。我们对两类代谢物进行比较分析。一些苯丙烷类化合物和聚酮类化合物、核苷酸及其衍生物也与暗褐网柄牛肝菌的风味和品质有关。
4. 脂类和类脂分子
在菌盖中的583种不同代谢物中，我们检测到198种脂类和类脂分子，包括91个脂肪酰基、43个异丙酚脂、28个甘油磷脂、27个类固醇及其衍生物、5个甘油脂质、3个鞘脂和1个内源性大麻素(补充文件S1)。在91个脂肪酰基中，大多数随着储存时间的延长而显著增加。G1（菌盖4℃储存0天）中以3-甲基己二酸、乙酰肉碱和顺-4-癸烯酸含量最高。在G13（菌盖4℃储存13天）中十二烷基肉碱、16-羟基-10-氧代十六烷酸和 asitrilobin D含量最高(图4)。在菌柄中(图5和补充文件S2)，脂类和类脂分子是最丰富的差异化合物，它们从B1（菌柄4℃储存0天）到B3（菌柄4℃储存3天）减少，B3之后，差异代谢物的数量增加。例如，B1 中的 8 种脂肪酰基化合物高于 B3，而B3 中的 17 种脂肪酰基化合物高于 B1。在这些壬酸中，1-羟基-3壬酮、eriojaposideB、11-羟基-9- tridecenoic
acid和癸二酸在B1中比在B3中更丰富。Annoglaxin、9-氧代十八碳二烯酸、(2E,4E)-2,4-octadien-1-醇、11-脱氢-血栓素 B
2
和 5,10-pentadecadien-1-醇在 B3 中的水平高于 B1。在B5 vs B3中，2-甲基丁酰卡尼汀、3-羟基2-甲基戊二酸、N-乙酰基-6-O-L-岩藻糖基-D-氨基葡萄糖、11-脱氢-血栓素B
2
、(10Z,14E,16E)-10,14,16-十八碳三烯-12-炔酸和(9S,10E,12Z,15Z)-9-羟基-10,12,15-亚麻酸的含量变化最大。与B5（菌柄4℃储存5天）相比（异戊基-β-D-葡萄糖苷、1-辛烯-3-醇葡萄糖苷、L-丁酰基肉碱、tetradecanedioic acid和3-羟基-2-甲基戊二酸表达水平较高），B7（菌柄4℃储存7天）中白三烯E3、19-hydroxy-PGE2和白三烯 F4 含量更高。在B13（菌柄4℃储存13天）vs B7中，只有1种化合物（白三烯E3）在B7中高于B13，有13种化合物在B13中高于B7，包括十二烷基肉碱、5,10-十五碳二烯-1-醇13,14-二氢、GF-1a1-(β-D-吡喃葡萄糖苷)-3-辛酮和11-羟基-9-tridecenoic
acid。
在异丙酚脂类中，我们在5组菌盖中共鉴定出42种不同的萜类化合物，包括12种三萜类化合物、9种二萜类化合物、7种倍半萜类化合物、6种萜烯苷、5种单萜类化合物和3种萜类内酯（补充文件S1）。
这些萜类化合物是暗褐网柄牛肝菌中重要的次生代谢产物，在生物体的代谢中发挥着重要作用。一些二萜类化合物（丹参新酮、3D,7D,11D-植烷酸、12'-Apo-bcarotene-3,12'-二醇、(24E)-3α-乙酰氧基-15α-羟基-23-oxo-7,9(11),24
-lanostatrien-26-oic acid和 Yucalexin P21)、4 种三萜皂苷和 3 种单萜在新鲜暗褐网柄牛肝菌中含量较高。然而，G1 中仅富含 1 种三萜类化合物（3-hydroxysintaxanthin）和倍半萜类化合物（armillaric acid）（图 6A）。随着储存时间的延长，三萜类化合物和倍半萜类化合物的含量逐渐增加。样品 G13 中二萜类化合物和萜烯苷化合物最丰富，包括stereobin E、紫苏苷 B 和annoglabasin C（图6A）。在菌柄中（图6B），萜类化合物的变化与菌盖中的相似，相关化合物的类别和丰度较高。B13中三萜类化合物的数量多于B1。B13中3-O-顺式香豆酰马斯里酸和β- citraurinene含量最高。与B1相比，annoglabasin C、二萜类化合物和3-O-顺式香豆酰马斯里酸的含量高于其他样品。在第一天的样品(菌盖和菌柄)中12'-Apo-bcarotene-3,12'-二醇、桃叶珊瑚苷、canavalioside、lubiminol、丹参新酮、视黄基-β-葡萄糖醛酸苷和Yucalexin P21的含量高于其他样品。
图6 低温储存下菌盖(A)和菌柄(B)中不同异丙酚脂类代谢物的热图聚类。
在菌柄和菌盖中，属于类固醇和甘油磷脂的不同化合物的数量随着储存时间的延长而增加(补充文件S1、S2)。
5. 有机酸及其衍生物
储存时间还影响一些与风味和品质相关的有机酸代谢物和衍生物。根据菌盖中的代谢比较（补充文件S1），77种不同代谢物被分配到8个不同的子类，其中63种代谢物来自氨基酸、肽和类似物（占不同有机酸及其衍生物总量的 85.71%）。G1中不同氨基酸、肽和类似物的数量减少。然而，氨基酸谱发生变化，并且在长期储存下不同氨基酸化合物的类别增加（图7A）。谷胱甘肽、Valyl-valine、肉桂酰甘氨酸和酵母氨酸在 G1 期最丰富，色氨酰-天冬氨酸盐、serylmethionine、S-(11-OH-9-脱氧-δ9,12-PGD2)-谷胱甘肽和γ-谷氨酰胺-4-羟基苯是 G3 （菌盖4℃储存3天）期最重要的化合物（图7B）。在 G3 中仅 2-氨基-3,4-二羟基戊二酸、threoninyl-谷氨酰胺和天冬酰胺酰色氨酸的水平显著高于 G5（菌盖4℃储存5天）（图 7C）。G5中，谷胱甘肽、谷氨酰胺、N-甲基谷氨酸和Valyl-valine的含量在储存3天后增加（图7C）。第7天N-氨甲酰-2-氨基-2-(4-羟基苯基)乙酸和半胱氨酰丝氨酸的表达水平较高(图7D)，而S-(PGA2)-谷胱甘肽、乙酰谷酰胺和精氨酰苯丙氨酸下降。对于长期储存，更多的氨基酸、肽和类似物发生显著变化，G13 中发生显著变化的化合物达到 13 种，例如视晶酸、DL-瓜氨酸和高水苏碱。其他一些化合物的表达也较低，尤其是神经降压素 11-13 和胱硫醚（图 7E）。在菌柄中，我们检测到 53 种不同的氨基酸化合物（补充文件 S2）。在13天的储存过程中，氨基酸化合物的含量变化显著，并且随着储存时间的延长而降低（图8A）。在B1中Valyl-valine、1-(γ-谷氨酰)环丙烷甲酸、酵母氨酸和γ-谷氨酰酪氨酸含量比在B3中更高(图8B)。乙酰谷酰胺、色氨酰 -天冬氨酸盐、2-(3-羧基-3-(methylammonio)丙基)-L-组氨酸、酪氨酰-丝氨酸和2-氨基-4-({2-[(1羧基-1-羟基-2
-甲基丙烷-2-醇) 硫醚]-1-[(羧甲基)-C- hydroxycarbonimidoyl]乙基}-C- hydroxycarbonimidoyl)丁酸是B3样品中的生物标志物。γ-谷氨酰-4-羟基苯、serylmethionine和 3-甲氧基多巴是 B5 中差异最大的氨基酸（图 8C）。B7 中的大多数氨基酸化合物含量减少，特别是 L-谷氨酰胺、hydroxyphenylacetylglycine、谷胱甘肽、indolylacryloylglycine。S-(11-OH-9-脱氧-δ9,12-PGD2)-谷胱甘肽和L-苯丙氨酰-L-脯氨酸在B7中显示出高表达水平(图8D)。在这些代谢物中，储存时间促进了乙酰基亮氨酸、乙酰谷酰胺、γ-谷氨酰苯丙氨酸、视晶酸等的表达（图8E）。
