原名： Huperzine A targets Apolipoprotein E: A potential therapeutic drug for diabetic nephropathy based on omics analysis

译名： 基于代谢组、转录组、微生物组和网药分析探讨糖尿病肾病潜在治疗药物石杉碱甲的作用机制研究

期刊： PHARMACOLOGICAL RESEARCH

IF： 9.1

发表时间： 2024.09

通讯作者： 胡丽丹

通讯作者单位： 浙江大学医学院附属儿童医院

使用考马斯亮蓝染色法测定了各组大鼠肾脏中的尿蛋白含量。给予Hup A后尿蛋白含量明显降低（图1A-B），同时肾脏指数在也显著下降（图1C）。DN组肾小球滤过率高导致大量蛋白尿可能与Scr水平低（图1D）有关。三组的BUN无明显差异(图1E)。对大鼠肾组织进行H&E和Masson染色，以评估Hup A治疗对DN大鼠组织学和形态学的影响(图1F)。H&E染色显示DN组肾小球基底膜增厚、系膜基质增加和肾小管空泡化。Masson染色显示，DN组的肾小球内出现纤维化病变，肾小管管腔和间质出现纤维化改变。此外从肾小球直径、肾小球硬化率和肾小管损伤评分来看，Hup A治疗显著减轻了肾小球和肾小管的损伤（图1G）。WB检测了维持正常肾小球滤过功能所必需的肾素和足素蛋白水平，如图1H所示，DN组的肾素和足素蛋白均明显下调（ P <0.05），Hup A治疗后可逆转了上述情况。

此外还通过CCK8检测法评估了Hup A在体外的细胞毒性作用，首先检测了不同浓度的Hup A对细胞活力的影响。结果表明，即使在200 μM的高浓度下，Hup A也不会明显影响细胞活力，这表明其具有极佳的安全性（图S1A）。此外观察还发现，用1 μM Hup A处理可降低炎症水平（图S1B），这与此前在大鼠模型中证明Hup A具有抗炎作用的研究结果一致。

为了评估Hup A在体内的潜在副作用，加入了第四个实验组（NC+Hup A，n=5），该实验组接受与NC组相同的治疗，但使用Hup A代替生理盐水（0.3mg/kg b.w.，每两天肌肉注射一次）。治疗一个月后与NC组相比，NC+Hup A组肝、肾功能参数和体重均无明显变化，血糖水平略有下降，但差异无统计学意义（ P >0.05）。结果与之前临床安全性数据相结合，进一步证实了Hup A的安全性。

图1 Hup A对DN大鼠肾脏的影响。(A)尿蛋白的考马斯亮蓝G250染色；(B)通过ELISA试剂盒检测大鼠uALB；(C)肾脏指数：肾脏重量/大鼠体重；(D)三组的Scr值。(E)BUN水平。(F)经 H&E和Masson染色 的代表性肾脏切片。蓝色箭头：肾小球基底膜增厚，黑色箭头：肾小球系膜基质增加。比例尺=50 μm；(G）对肾小球直径、肾小球硬化率和肾小管损伤评分进行量化，以观察肾小球肥大和肾损伤情况。(H）大鼠肾脏中肾素和足素的相对蛋白水平和定量分析（n=3）。* P < 0.05，** P < 0.01，*** P < 0.001，**** P < 0.0001。

为了深入研究Hup A治疗DN的分子机制，进行了转录组测序并分析了差异表达基因（DEGs）。如图2A与DN相比，在NC中发现了444个DEGs，其中255个下调，189个上调。与Hup A+DN组相比，DN组出现了81个DEGs，包括33个下调基因和48个上调基因（图2D）。与Hup A+DN组相比，NC组共鉴定出502个DEGs，包括283个下调基因和219个上调基因（图S2A）。在DN组中观察到Apoe和Apoc2大量上调，这种上调在Hup A处理后显著降低。

随后进行了GO分析，以确定DN和Hup A处理诱导的重要功能DEGs。如图2B所示，与DN相比NC通路主要富集了肾脏发育、肾脏系统发育、肾小球发育和脂质代谢过程（包括极低密度脂蛋白颗粒和富含甘油三酯的血浆脂蛋白颗粒）等过程。学习记忆和脂质代谢（脂肪酸代谢过程、低密度脂蛋白颗粒、高密度脂蛋白颗粒、血浆脂蛋白颗粒和脂蛋白颗粒）在DN与DN+Hup A中富集。KEGG通路富集分析结果如图2C所示，与DN组相比，NC组富集了糖尿病并发症的PPAR信号通路和AGE-RAGE信号通路。在NC与DN和DN与DN+Hup A的比较中，脂质代谢过程多次被富集，表明Hup A治疗对DN大鼠的脂质代谢有显著影响（图2E-F、S2B-C）。

采用非靶向代谢组分析的主成分分析（PCA）和偏最小二乘判别分析（PLS-DA）分析（图S2D）来研究肾脏代谢的变化。NC组和DN组的样本表现出显著分散性，而DN+Hup A组的样本分布更接近NC组，这表明Hup A治疗可以恢复DN大鼠的新陈代谢。对NC组和DN组比较后发现，有36种代谢物受到不同程度的调节，其中34种代谢物上调，2种下调。鞘氨醇、16（R）-HETE和花生四烯酸（AA）在DN组明显上调，而在Hup A治疗后，鞘氨醇和16（R）-HETE显著下调，这表明这些物质可能参与了Hup A治疗DN的机制（图3A）。

我们通过对KEGG通路数据库进行分析，以确定相关的疾病通路、代谢通路和信号通路。图3B显示了前25个富集的疾病通路，包括慢性肾功能衰竭、慢性肾病和衰老相关代谢物，这意味着Hup A在DN中具有保护作用。图3C中展示了前20个富集的代谢通路和信号通路，主要包括AA代谢、细胞凋亡和PPAR信号通路。因此Hup A对DN的缓解作用可能与这些途径有关。

利用16S rRNA测序来评估Hup A治疗对肠道微生物群的影响。收集了多个时间点（第0天、50天和100天）的粪便样本，以研究肠道微生物群在DN进展过程中的动态变化。在图4A中，DN组的Shannon多样性指数降低，而DN+HupA组的Shannon多样性指数升高，表明Hup A治疗改善了微生物群的多样性。图4B显示，优势菌群（门水平）包括厚壁菌门、疣微菌门、放线菌门、拟杆菌门和脱硫杆菌门。如图4C所示，Hup A处理提高了DN降低的瘤胃球菌和大肠杆菌属丰度，同时降低了链球菌属、考拉杆菌属、肠球菌属、 Blautia 菌属和埃希氏菌属的丰度。

此外构建了一个优势物种网络，以阐明不同微生物（前50个OTUs）之间的相互作用，红线表示正相关，绿线表示负相关（图4D）。在NC组中乳酸杆菌的丰度极高。相比之下葡萄球菌和考拉杆菌的丰度较低。有趣的是葡萄球菌和考拉杆菌与乳酸杆菌呈负相关。在NC组中 Blautia 的含量也极低，但它与乳酸杆菌呈正相关。此外还将16S测序结果与KEGG和MetaCyc数据库相结合，进行了功能预测。图4E显示了KEGG预测的二级功能通路，其中氨基酸、碳水化合物和脂质代谢显著富集。图4F显示了MetaCyc预测的二级功能通路，其中氨基酸生物合成、脂肪酸和脂质生物合成以及糖酵解显著富集。这些结果表明，Hup A可通过调节肠道微生物群的组成以及涉及碳水化合物、脂类和氨基酸的关键代谢过程来发挥DN保护作用。

如图S2E随着时间的推移，NC组的Shannon指数呈上升趋势，而DN组和DN+Hup A组的Shannon指数呈下降趋势，但没有统计学差异。

为了阐明DEGs与代谢物之间的联系，对代谢组和转录组进行了Spearman相关性分析（图5A）。Hup A处理后显著下调的关键基因（Apoe和Apoc2）与脂质代谢生物标志物（鞘氨醇、16(R)-HETE和AA）之间的相关性。结果表明Apoc2与16(R)-HETE呈显著正相关，而Apoe、Apoc2和AA与鞘氨醇无显著相关。

对代谢组和微生物群进行Spearman相关性分析，以确定代谢物与微生物群组成（属水平）之间的关系。如图5B所示，AA与葡萄球菌呈显著正相关。鞘氨醇和16(R)-HETE与肠球菌呈显著正相关，与链球菌、考拉杆菌、布氏杆菌和埃希氏菌属呈正相关，与瘤胃球菌属和考氏杆菌属呈负相关。此外还建立了定向检测鞘氨醇的质谱方法。结果表明鞘氨醇在DN中增加，经Hup A处理后恢复到对照组水平。

本研究已经在大鼠和小鼠疾病模型、临床DN样本和高血糖细胞模型中，对Hup A对DN的影响进行了验证。随后通过qR-PCR验证了糖尿病大鼠肾组织中Apoe和Apoc2的mRNA水平，并通过WB验证了Apoe的蛋白水平，其结果与转录组数据一致（图6A-B）。此外在糖尿病大鼠、db/db小鼠组、糖尿病肾病患者的肾小球和肾小管中，Apoe和Apoc2的免疫荧光染色均表现为高信号，经Hup A处理后，大鼠肾组织切片的荧光信号减弱（图6C），在高糖肾细胞模型中也发现了同样的趋势(图6D）。

通过QP和WB验证si RNA的效率的方法见图7E-F。此外细胞模型中的 si-Apoe 能改善高糖引起的炎症状态（图7G）。进一步检测了大鼠的血脂水平，发现Hup A治疗可以改善糖尿病大鼠的高甘油三酯血症(图S1C)。综上所述，这些实验数据证明了Apoe在Hup A治疗DN疾病中的保护作用。

了解Apoe与DN相关生物标志物的临床相关性对于评估其在临床实践中的适用性以及将Hup A作为一种治疗方案的可行性至关重要。为了填补这一差距分析了DN患者Apoe表达与各种临床生物标志物之间的关系。共有428例DN患者被纳入进一步分析（图7A）。这些图表说明了临床生物标志物与Apoe表达水平之间的关系（见表S2）。

作为血糖控制水平的指标，HbA1c与Apoe呈正相关，表明Apoe的表达随HbA1c水平的升高而增加。在肾功能方面，当蛋白尿水平较高时，Apoe的表达与24小时尿蛋白水平呈强正相关，表明随着蛋白尿水平的升高，Apoe的表达也随之升高。然而Apoe与EGFR、UAER和Scr的相关性较弱，且无统计学差异。ALB和Apoe之间的相关性是显著的非线性（图7B，表S2）。

Apoe是脂质代谢的关键因素，因此我们还研究了Apoe表达与脂质谱之间的关系。研究结果表明，Apoe的表达与血脂相关生物标志物（包括TG、HDL-C、LDL-C、TC、Apoe AI和Apoe B）之间存在明显的正相关性（图7C）。随着这些脂质生物标志物水平的增加，Apoe的表达水平也呈上升趋势，其中大多数关系具有统计学意义（ P <0.001）。

此外还研究了Apoe与炎症指标（尤其是CRP和HsCRP）之间的关系。结果表明，Apoe表达与HsCRP水平之间存在显著的整体关系，且存在显著的非线性关系（非线性关系的P=0.007）。此外小提琴图显示四个HsCRP组的Apoe表达情况（图7D）。分析表明，从HsCRP最低的组别到最高的组别，Apoe表达量逐渐增加，某些组别之间存在显著差异。这些发现突显了不同炎症水平下Apoe表达的动态变化。

为了研究Apoe在DN中的作用，使用RNA干扰技术敲低了Apoe的表达。用 si-Apoe 转染HPC，并通过qRT-PCR和WB分析确认其敲除效率（图7 E-F）。Apoe基因敲除导致炎症减轻、细胞粘附性增强和细胞活性提高（图7 G-I）。WB分析表明，与NC组相比， si-Apoe 组中自噬体标记物LC3B II/LC3B I蛋白表达显著下降，表明葡萄糖诱导自噬水平升高，而 si-Apoe 则降低了自噬水平。另一种自噬标记物Beclin-1在葡萄糖处理后降低，在 si-Apoe 处理后升高。此外由于LC3B I与p62聚集物螯合，当自噬功能受损时，p62会聚集。 si-Apoe 足细胞中的p62聚集增加，这表明HPC的自噬水平因载脂蛋白被敲除而降低（图7J）。

通过筛选ChEMBL、CTD、Genecard和STICH数据库并剔除重复数据，收集到了89个Hup A的潜在靶标。通过筛选DisGeNET、DrugBank、GeneCards和TTD数据库并去除重复数据，获得了DN的1720个潜在靶标。通过寻找Hup A和DN靶蛋白的交叉点，发现33个共同靶点并用于进一步分析(图S3)。

为了进一步探索Hup A与DN靶蛋白之间的相互作用，将33个共同靶蛋白导入STRING数据库，构建了PPI网络，其中包括33个节点和145条边（图S3D）。结果表明凋亡相关蛋白（Bax、Bcl-2和Caspase3）可能是DN的潜在靶标，基于11种算法的网络模型拓扑分析进一步证实了上述关键靶标。

随后利用药物-疾病靶点的GO和KEGG通路富集分析来探索Hup A治疗DN的潜在分子机制。从GO分析中富集的分子功能（Molecular Function，MF）、生物过程（Biological Process，BP）和细胞组分（Cell Component，CC）术语见图S4B。BP术语主要包括细胞对化学应激的反应、对氧化应激的反应以及对异生物刺激的反应。MF术语主要包括内肽酶活性、蛋白酶结合和丝氨酸水解酶活性。CC术语包括内质网腔、膜微域。此外图S3F显示了KEGG通路的前20个富集途径。其中包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、细胞凋亡、鞘脂信号通路和细菌感染（沙门氏菌感染、幽门螺杆菌感染和致病性大肠杆菌感染中的上皮细胞信号通路），这表明了Hup A治疗DN的潜在机制。评估了肾组织中Bcl-2和Bax的蛋白水平，它们在细胞凋亡过程中发挥着重要作用。与NC组相比，DN组的细胞凋亡率更高。Hup A治疗降低了Bax/Bcl-2的mRNA和蛋白水平（图S3G-H），表明Hup A可通过控制细胞凋亡来改善凋亡。

在高热量饮食和食物供应增加的推动下，全球糖尿病（DM）患病率激增，导致糖尿病成为一种普遍的代谢性疾病。DN是DM的一种严重并发症，是导致肾衰竭的主要原因，并大大增加了患者的死亡率。DN的发病机制复杂，涉及氧化应激、炎症、纤维化和细胞凋亡。研究发现Hup A对糖尿病大鼠具有显著的降血糖和抗炎作用。然而其更广泛的保护作用，尤其是对肾功能的保护作用，仍未得到充分探索。为了解决这个问题采用了一种多组学方法，整合了转录组学、代谢组学、肠道微生物组分析和网络药理学，以阐明Hup A影响DN的分子机制。

尿蛋白（主要是白蛋白）含量是肾功能的常用指标，也是DN的常见生物标志物之一。临床研究发现T2DM患者的循环Apoe水平与尿白蛋白排泄有关，而Apoe与肾小球功能调节和系膜细胞增殖有关。此外血清Apoe可能是糖尿病视网膜病变（DR）更重要的预后指标，并与DR的严重程度相关。与这些发现一致的是，在高血糖条件下Apoe和Apoc2上调，而在大鼠模型、糖尿病小鼠、临床DN组织标本和高血糖细胞模型中，Hup A逆转了这种上调（图6）。进一步分析证实在临床数据中，DN相关生物标志物、HbA1c和24小时尿蛋白水平与Apoe表达呈正相关，这表明Apoe有可能成为DN的治疗靶点（图7B）。随着DN的进展，早期肾小球滤过功能亢进导致Scr水平较低，晚期由于肾小球硬化晚期滤过功能下降，Scr水平较高。肾蛋白和足蛋白在足细胞足突中高度表达，在裂孔隔膜的过滤功能中起着至关重要的作用。肾素-podocin信号传导异常可能导致足细胞功能障碍，从而引起蛋白尿和其他肾小球症状。研究结果表明，Hup A可改善DN大鼠的肾小球损伤，表现为蛋白尿减少、肾蛋白和足蛋白水平恢复（图1H）。因此进一步探讨了Hup A如何通过下调载脂蛋白发挥其肾脏保护功能。

由脂质积累及其代谢产物驱动的脂毒性是DN发病机制中的一个关键因素。转录组学分析显示，DN组中参与脂质代谢的关键脂蛋白Apoe和Apoc2有明显上调。Hup A治疗逆转了这种上调，表明脂质代谢得到了改善。同时Apoe含量与大多数临床血脂谱有显著的正相关性（图7C）。Apoe通过与细胞表面受体结合，促进胆固醇和其他脂质摄入细胞，从而调节脂质代谢。Apoe对脂质代谢至关重要，可促进脂质清除并调节脂质代谢调节。在研究中DN组Apoe和Apoc2的上调可能与脂质积累有关。同时Hup A治疗后Apoe和Apoc2的下调可能表明脂质代谢紊乱得到了改善。

此外分析强调了与脂质代谢、认知功能以及PPAR和AGE-RAGE信号通路有关的通路的富集，这些通路是DM和DN发病机制的核心（图2-3）。PPAR受体，尤其是PPARγ，是脂质代谢的关键调节因子，它们在DM中的作用已被广泛研究。AGE-RAGE通路介导氧化应激和炎症，也与DN进展有关。在之前的研究中，发现给药Hup A能显著降低空腹血糖水平。高血糖是DN的关键致病因素，会导致氧化应激、炎症和肾脏纤维化。通过有效降低血糖水平，Hup A可以阻断这些病理过程，从而保护肾功能。因此Hup A可减少蛋白质的糖化和随后形成的晚期糖基化终末产物（AGEs）。同时Hup A在DN中发挥重要作用的靶基因Apoe也与临床患者的许多脂质相关生物标志物显著相关（图7）。总之Hup A对DN的保护作用似乎与脂质代谢密切相关，并涉 PPAR和AGE-RAGE通路。

研究还发现Hup A治疗后，鞘氨醇和16(R)-HETE等脂质代谢物明显减少（图3）。鞘氨醇通过调节转录因子的磷酸化促进细胞凋亡，从而导致Bcl-2家族的失衡，例如Hup A通过增强抗氧化酶的活性、降低Bax和Caspase-3蛋白水平以及提高Bcl-2蛋白水平，通过抗氧化和抗凋亡途径发挥保肝作用。代谢组学和生化结果表明了Bcl-2和Bax基因表达和蛋白水平的变化（图3C和S3H）。

从临床DN患者的炎症角度来看，HsCRP和Apoe之间的显著相关性强调了Apoe在调节炎症反应中的作用（图7D）。HsCRP与Apoe之间的非线性关系可能反映了Apoe在调节对不同炎症状态的反应中的作用，尤其是在极端炎症条件下（CRP水平极高或极低）。 Si Apoe 实验进一步验证了在高血糖模型中敲除Apoe可减少足细胞炎症，增强细胞粘附性和活力（图7G-I）。此外Hup A还能降低体外和体内炎症细胞因子IL-10和TNF-α的水平（图7G和图S1B）。总之研究表明，Hup A对DN的影响与调节脂质代谢、抑制细胞凋亡和抗炎作用密切相关。

在DN的早期阶段，自噬通常被认为具有保护作用，通过以去除受损的细胞器和蛋白质来防止足细胞损伤。然而在DN的晚期阶段，由于长期高血糖和氧化应激，自噬的持续激活会导致不适应反应。这种长期的自噬会加剧足细胞损伤，并通过促进凋亡和纤维化而导致DN的进展。研究表明在糖尿病的情况下，自噬通常会失调。研究发现高血糖会诱导足细胞自噬。具体来说LC3II/LC3I的比率趋于升高，表明自噬通量增强，尤其是在糖尿病的早期阶段。这种增加反映了细胞试图应对高血糖造成的压力和损伤。然而在DN的晚期，慢性高血糖和氧化应激可能会导致自噬的持续激活，从而变得适应不良并导致足细胞损伤、凋亡和DN的进展。研究结果表明，Hup A可通过调节Apoe的表达以及防止过度自噬和细胞凋亡来减轻这些影响（图7J和图S3G-H）。

Meijers和其团队提出肠道微生物群的变化可通过调节代谢物影响肾脏健康。一些研究表明，部分中药和天然提取物可以改变肠道微生物群，降低患DN的风险。肠道可以消化和吸收营养物质，并起到屏障保护作用。研究表明肠道微生物群失调会破坏肠道的通透性，使毒素和致病菌进入血液。这一过程会引发炎症介质的产生，减少短链脂肪酸，增加胰岛素抵抗，从而加速糖尿病的发展。这些发现也证明了之前的研究中观察到的Hup A治疗DM大鼠能显著逆转血清炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α和 TGF-β。在本研究中，DN大鼠的乳酸杆菌数量显著减少，而Hup A处理增加了 Colidexibacter 和 Ruminococcus 的数量，同时减少了 Enterococcus 和其他菌类的数量（图4）。乳酸杆菌是肠道中的重要优势菌株，与DM密切相关。值得注意的是，副干酪乳杆菌具有大量的α-葡萄糖苷酶抑制活性，从而通过影响葡萄糖代谢有效降低DM小鼠的血糖水平。乳酸菌排出的代谢产物，如短链脂肪酸（SCFAs），具有调节结肠调节性T细胞发育、减少炎症细胞浸润和抑制炎症以维持黏膜平衡的免疫反应能力。有文献表明通过抑制TLR4/NF-κB/NLRP3炎症通路，提高 Colidexibacter 的丰度可减轻大鼠体重和脂肪沉积。

肠道微生物群分析表明，Hup A治疗后微生物组成发生了显著变化，特别是增加了有益菌 Colidexibacter 和 Ruminococcus ，同时减少了致病菌 Enterococcus ，这些变化可能有助于改善DN的脂质代谢和肾功能。相关性分析进一步证实了特定微生物群与脂质代谢生物标志物之间的联系，突出了Hup A恢复微生物群平衡和调节脂质代谢的潜力（图4）。网络药理学分析证实发现，强调了Hup A参与脂质代谢、微生物感染和细胞凋亡。

总之通过整合转录组、代谢组和微生物群研究结果，发现Hup A再减轻DM诱导的肾损伤、脂代谢紊乱和炎症具有良好的疗效。整合转录组和代谢组分析发现，Hup A主要改变了参与脂质代谢的关键基因（即Apoe和Apoc2）的转录水平，并调节了鞘氨醇、16(R)-HETE和AA等脂质代谢标志物的水平。此外Hup A还能有效改善DN导致的肠道微生物群失调。Spearman相关分析表明，脂质代谢指标与肠道微生物群相关。本研究首次评估了多种模型（糖尿病大小鼠、糖尿病患者、高血糖细胞模型）Apoe和Apoc2在DN中的表达，提示Hup A可能通过调节载脂蛋白的表达参与保护DN。临床数据表明，Apoe有可能成为DN的生物标志物和潜在靶点。细胞水平的研究进一步阐明了敲除Apoe基因对足细胞的保护作用。研究结果还为今后Hup A的适应症和用法研究奠定了基础，肾脏组织样本量较小，特别是考虑到肠道微生物群和代谢的固有变异性，这可能会导致假阴性。此外各种omics数据之间的逻辑整合也不尽如人意。为了解决这个问题，用大型临床数据集和基因敲除实验来补充本研究结果，以加强结论。展望未来开展纵向研究以监测DN患者体内载脂蛋白水平和临床生物标志物的动态变化至关重要。此外有必要在更大范围内进一步验证我们的多组学数据，以充分确定Hup A的治疗潜力。