图1显示了起泡苹果酒样品制备流程图。通过非靶向代谢组学技术，我们在PAJ（经过85℃加热15分钟巴氏杀菌处理的苹果酒样本）、BW（使用 S. cerevisiae WLS21酵母菌株对PAJ进行第一次发酵后得到的基础葡萄酒）、PBW（在BW中添加蔗糖调整至10 ^o Brix后，再次于85℃加热15分钟巴氏杀菌处理得到的样本）、SMW（在PBW中接种 S. cerevisiae 酿酒酵母菌株进行二次发酵，7天后（压力0.3 MPa）得到的中期样本）和SLW（在PBW中接种 S. cerevisiae 酿酒酵母菌株进行二次发酵，30天后（压力0.6 MPa）得到的后期样本）中检测到总计634种非挥发性代谢物（见表S3），包括161种脂类、41种黄酮类、32种酚酸、79种氨基酸及其衍生物、24种核苷酸及其衍生物、57种有机酸及其衍生物、9种生物碱、34种糖类、8种醇类、8种香豆素、11种酚类和其他170种化合物。QC和样本总离子流图（TIC）的叠加分析显示，本研究记录的数据具有良好的重复性和可靠性（见图2-a，2-b）。我们采用主成分分析（PCA）进行全面分析（见图2-c），揭示了果汁（PAJ）、初二次发酵组（BW、PBW）和二次发酵组（SMW、SLW）之间可以区分开来。这表明两二次发酵过程都导致了非挥发性代谢物的重要变化。为了进一步观察发酵样本之间的差异，我们进行了有监督模式下的OPLS-DA分析（见图2-d）。尽管四组样本位于四个象限，但R ² X[2]只解释了X矩阵的5.69%，这表明巴氏杀菌对基础苹果酒的非挥发性物质影响较小。此外，SMW和SLW样本分别位于第三和第四象限，表明从中到后期发酵阶段，非挥发性物质的变化较为缓慢。

图1 起泡苹果酒样品制备流程图

图 S1 展示了发酵后非挥发性化合物总含量的聚类热图。酚酸和黄酮类化合物位于相邻的聚类分支中，它们的含量在二次发酵后有所下降。氨基酸和生物碱位于同一聚类中，且在苹果酒中含量最高。与氨基酸的变化相反，有机酸和脂类位于同一聚类分支中，与核苷酸相近，它们的含量在两二次发酵过程中逐渐增加。这是因为酵母在代谢糖和氨基酸时合成了生物分子（如脂肪酸和核苷酸）所需的能量和碳骨架。由于低温、低pH值和高压等应激环境的存在，酵母积累脂类以抵抗外部压力，而脂类组成的变化又导致氨基酸运输或膜ATP酶活性的变化。

基于差异倍数（FC）、q值以及OPLS-DA分析得到的VIP值，我们对五个比较组（PAJ与BW、BW与PBW、BW与SLW、PAJ与SLW、SMW与SLW）之间的差异表达代谢物进行了筛选（见图S2），筛选条件设定为FC ≥ 2或≤1/2，q值 ≤ 0.05，VIP ≥ 1，共筛选出226种不同的物质（见表S2）。其中，基础苹果酒与苹果酒之间有156种差异代谢物（见图3-a，104种上调和52种下调），起泡苹果酒与苹果酒之间有195种差异（见图3-d，132种上调和63种下调）。这表明二次发酵过程仍然影响了某些苹果酒成分。仅在二次发酵阶段，差异数量为86种（BW与SLW，见图3-c，65种上调和21种下调），而在二次发酵的中后期，我们观察到19种差异（SMW与SLW，见图3-e，8种上调和11种下调）。根据维恩图的统计结果，从SMW到SLW发酵过程中唯一独特的差异化合物是植物鞘氨醇1-磷酸（见图3-f），它主要负责在代谢过程中调节鞘脂的平衡。此外，在巴氏杀菌前后，我们共检测到16种差异代谢物（BW与PBW，见图3-b，14种上调和2种下调）。这表明两个发酵阶段对起泡苹果酒中非挥发性化合物的变化有显著影响，而二次发酵时间和巴氏杀菌的影响相对较小，这与第1部分的结果一致。

为了更直观地观察不同代谢物之间的变化，我们制作了包含226种不同代谢物的热图（见图4），以下为相应的分析结果。

在起泡苹果酒的发酵过程中，氨基酸及其衍生物是变化最为显著的非挥发性化合物。它们不仅能够提供清新的口感，还参与香气物质的形成。在初二次发酵后，氨基酸经历了显著的转化，许多氨基酸的含量显著下降，例如缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-组氨酸和亮氨酰亮氨酸（见图4-c）。支链氨基酸的转化是发酵葡萄酒中香气成分形成的重要步骤。Ye等人在苹果酒发酵过程中观察到苏氨酸和天冬氨酸的耗竭，这与我们检测到的结果一致。

在二次发酵后，与基础苹果酒相比，起泡苹果酒中的几种氨基酸含量有所增加，例如L-蔗糖氨酸、D-丙氨酸、D-焦谷氨酸、谷氨酸、还原型谷胱甘肽、酪氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸。这表明酿酒酵母可能具有在应激条件下从头合成氨基酸的能力。这可能与二次发酵前添加的糖分、瓶内封闭发酵环境中除了糖分之外营养物质较少、高乙醇含量以及高CO ₂ 压力有关，这些应激条件激活了酵母细胞应对细胞死亡和自溶的转录和翻译机制。其中，谷氨酸和D-丙氨酸可能对最终起泡苹果酒产品的新鲜感和甜度产生积极贡献。

在二次发酵过程中，与基础苹果酒相比，起泡苹果酒中的多种有机酸和脂质化合物的含量发生了显著变化（见图4-a、4-b），这一阶段是酵母代谢果汁成分的关键时期。在此期间，酵母代谢产生了多种有机酸（例如乳酸、琥珀酸、丙酸）和脂肪酸。这些有机酸不仅是碳水化合物代谢的关键中间体，而且对产品的酸度有显著影响。而产生的脂肪酸则作为复杂脂质的前体，在能量储存时可合成甘油酯、鞘脂和磷脂，它们在随后的代谢过程中被降解为乙酰辅酶A并循环用于其他合成过程。因此，尽管在二次发酵期间脂质化合物的总含量有所增加，但某些脂肪酸（如9-羟基-(10E,12E)-十八碳二烯酸）的含量减少仍然明显。此外，我们观察到甘氨胆酸和甘氨脱氧胆酸在第一次发酵后显著上调。在二次发酵期间，除了甘氨胆酸和甘氨脱氧胆酸继续上调外，甘油磷酸胆碱也显著上调，这表明在应激环境下，酿酒酵母仍能转化脂质以维持正常的生长代谢。

在二次发酵前，作为碳源补充了蔗糖。然而，在压力发酵中期，即瓶内压力达到0.3 MPa时，大约98%的蔗糖已被消耗，到二次发酵结束时，蔗糖含量下降了99%。相比之下，苹果酒中的蔗糖在第一次发酵结束时仅下降了1.27%。这表明，在苹果酒营养丰富时，蔗糖并非首选的碳源，而在二次发酵中，由于营养物质稀缺，蔗糖成为了主要的碳源。此外，第一次发酵导致果汁中存在的α,α'-海藻糖6-磷酸和D-果糖6-磷酸耗尽，二次发酵除了蔗糖、海藻糖和某些糖苷的减少外，还产生了如阿洛糖和山梨醇等糖类化合物（见图4-d）。这可能归因于在压力条件下，鸟苷酸5'-二磷酸-D-甘露糖（GDP-mannose）参与激活酵母细胞中的糖新生物合成。

多酚类物质是果酒中重要的生物活性分子，它们影响着酒的风味、色泽和整体口感。酵母发酵主要导致了苹果中多酚类物质的降解，包括香草酸、儿茶素、表儿茶素和原花青素（见图4-e, -f）。这似乎与葡萄酒中原花青素和儿茶素含量的不一致变化有关。相反，巴氏杀菌处理则导致了儿茶素、表儿茶素和原花青素含量的上调，这与Murtaza等人研究的苹果酒经高温处理后的多酚类表现一致，这归因于苹果中的酶促褐变反应。

在起泡苹果酒的发酵过程中，检测到芹菜素、柚皮素和紫杉叶素（二氢槲皮素）的含量上调，这表明酿酒酵母中存在苯丙烷代谢途径的关键酶，这些酶调节黄酮类化合物的合成。根据先前对生物体内苯丙烷代谢途径的研究，酪氨酸和苯丙氨酸分别通过酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonia lyase,TAL）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase,PAL）转化为肉桂酸和对羟基肉桂酸。随后，4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate-CoA ligase,4CL）作用下生成的香豆酰辅酶A可作为黄酮类代谢的重要前体物质，进一步生成诸如柚皮素和儿茶素等多种黄酮类化合物。

发酵过程显著改变了苹果酒中的核苷酸组成（见图4-g），在第一次发酵后，2-甲氧基腺苷、腺苷、鸟苷、腺嘌呤和鸟嘌呤的含量略有上升，但在二次发酵期间，所有核苷酸及其衍生物的含量均显著增加。这表明酿酒酵母在压力环境下仍然保持较强的活性。特别是，鸟苷二磷酸甘露糖（GDP-mannose）和鸟苷 3',5'-环单磷酸（ guanosine-3′,5′-cyclic monophosphate,cGMP）对于细胞葡萄糖代谢稳态至关重要，它们帮助酵母细胞感知周围环境中的营养物质水平并调节细胞周期。这两种化合物含量的上升意味着Y41能够在压力条件下完成糖异生过程，产生新的代谢物，并维持自身的生命活动。

发酵过程显著调整了苹果酒中的B族维生素组成，在二次压力发酵中重新合成了硫胺素和吡哆醇（见图4-h）。此外，二次压力发酵还提高了苹果酒中吲哚丙酸和鞘磷脂的水平。这些化合物影响细胞增殖和凋亡、脂质代谢以及氧化应激。研究表明，酿酒酵母能在压力环境下维持正常的鞘脂代谢。吲哚丙酸作为一种抗氧化剂，在二次应激发酵中上调，有助于保护Y41免受氧化应激的损害。

此外，发酵过程中烟酸和尼克酰胺的含量有所下降，而它们的次级产物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ⁺ ）含量则有所增加。NAD ⁺ 是氧化还原反应中的辅酶，也是能量代谢的中心物质，能够直接或间接影响许多关键的细胞功能，包括代谢途径、DNA修复、染色质重塑和细胞衰老。基础苹果酒在第一次发酵后以及起泡苹果酒在二次发酵后的NAD ⁺ 含量稳定，表明酵母细胞在正常发酵（WLS21）和应激发酵（Y41）条件下均保持了正常的代谢活动。

通过使用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS），我们在三个样本组别中鉴定了总共83种挥发性代谢物，包括21种醇类、8种酸类、10种醛类、5种酮类、9种萜类和30种酯类（其中11种为醋酸酯，10种为乙酯，其余9种为其他酯类）。这些代谢物在巴氏杀菌苹果酒（PAJ）、基础苹果酒（BW）和次级发酵晚阶段苹果酒（SLW）中的含量均有所增加，其中醇类、醋酸酯和乙酯是最为丰富的化合物。然而，并非所有挥发性化合物都能被人的嗅觉所感知，这取决于它们的阈值。根据气味活性值（OAV）大于1的标准，分别在苹果酒、基础苹果酒和起泡苹果酒中筛选出4种、9种和14种可能被感知的挥发性化合物。同时，我们根据第2部分中的筛选方法，总共获得了54种挥发性差异代谢物。如图5-b所示，这54种差异挥发性代谢物被聚类为6个簇，其中包括14种OAV大于1的化合物。

在起泡苹果酒的发酵过程中，第1和第2簇中的化合物主要存在于基础苹果酒和起泡苹果酒中，包括11种挥发性化合物（8种酯类和2种萜类），其气味活性值（OAV）大于1。酯类对香气的贡献远大于醇类，这是因为只有一种醇类化合物（2-甲基-1-丁醇）的浓度超过了其嗅觉阈值，且仅在果汁和基础苹果酒中可感知，而在次级发酵晚阶段酒样（SLW）中未检测到。这种缺失与用于二次发酵的特定菌株有关。尽管在SLW样本中没有发现醇类化合物对香气有显著贡献，但3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和2,3-丁二醇的浓度显著增加（见图5-b，第1、2簇），这些化合物已知能提供果香和甜香。醇类浓度的变化表明，二次发酵涉及氨基酸的合成和分解（Ehrlich途径）。所有萜类化合物（香茅醇、香叶醇、芳樟醇和橙花叔醇）除β-大马酮外均位于第1簇，表明微氧环境有利于萜类化合物的积累。香叶醇和芳樟醇也被发现存在于啤酒花和啤酒中，其中芳樟醇被认为是啤酒花香香气的重要贡献者。

第3簇中的化合物主要存在于苹果酒中，包括具有OAV大于1的己醛，这是甜香和柑橘香气的主要贡献物质。第4簇中的三种差异化合物主要存在于基础苹果酒中，其中乙酸乙酯可以通过酿酒酵母转化为2,3-丁二醇。我们在次级发酵晚阶段酒（SLW）中检测到2,3-丁二醇表明，在压力条件下，酿酒酵母存在这一代谢过程。第5和第6簇中的11种差异挥发性化合物在第一次发酵后减少，但在二次发酵后增加。其中，3-辛酮在SLW中的OAV大于1，可能会为葡萄酒增添草本和脂肪风味。甲基酮的产生被认为主要与脂肪酸的β-氧化有关。因此，二次发酵后3-辛酮和2-壬酮（第1簇）的增加表明，在压力条件下，酿酒酵母能够高效地进行脂肪酸代谢。相比之下，高级醇（1-丁醇、1-己醇、1-庚醇和1-辛醇）浓度的上升表明Y41转向氨基酸的利用。

由于巴氏杀菌和二次发酵时间对非挥发性化合物的影响较小，代谢通路分析主要集中在两个发酵阶段的代谢变化上，其中第一阶段发酵的三个节点是从苹果汁到基底苹果酒（正常发酵），以及从基础苹果酒到起泡苹果酒（压力发酵）的二次发酵。基于KEGG数据库，两个发酵阶段的差异代谢物与特定代谢通路相关联，并通过富集分析获得了基本代谢通路（见图6-a, -b）。结果显示，两个发酵阶段共有的代谢通路包括天冬氨酸、硫胺素、嘌呤、谷氨酸、谷胱甘肽代谢以及超长链脂肪酸的β-氧化。氮素稳态和能量转运，包括丙酮醛降解、甲基组氨酸、赖氨酸、β-丙氨酸代谢、肉碱合成和磷酸甘油穿梭主要在第一次发酵阶段得到促进。相比之下，二次发酵阶段与苯乙酸代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢、乙醇降解、海藻糖降解、激素合成、线粒体短链脂肪酸的β-氧化以及氨基糖代谢相关。此外，关键代谢途径包括儿茶酚胺和B族维生素代谢、辅酶Q生物合成以及烟酸和尼克酰胺代谢。其中，辅酶Q在无氧和有氧相互作用中发挥重要作用。这些通路的富集表明，在恶劣环境和营养缺乏的压力环境下，酿酒酵母可能降解海藻糖。通过糖酵解或进一步利用短链脂肪酸为细胞生长提供能量，并影响B族维生素和苯丙烷代谢通路。

相关代谢物与挥发性香气化合物的关联分析是通过皮尔逊相关性分析进行的，相关系数大于0.8且 p 值小于0.05的结果被提取并绘制在相关性网络图中（见图6-c）。点的度数表示化合物的节点数，即相关联化合物的数量。实线表示正相关，两个化合物可能来自相同的生物合成途径。相反，虚线连接的负相关化合物表明它们可能是分解代谢途径的底物和产物。显然，核苷类化合物分散在相关性网络的中心，主导了发酵过程中有机酸和香气化合物的形成。特别是以鸟嘌呤和腺嘌呤代谢为中心，与香气化合物β-大马酮、芳樟醇、2,3-丁二醇、苯乙醇、3-甲基丁酸乙酯、乙酸、乙酸乙酯呈正相关，与丙酮酸和己醛呈负相关。此外，与海藻糖和天冬氨酸相关的化合物大多呈负相关，表明它们主要作为发酵底物存在；相反，谷氨酰胺、咪唑-4-乙醛、硫胺素和吡哆醇主要呈正相关，表明它们主要作为发酵产物存在。包括果糖6-磷酸、组氨酸、天门冬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸以及与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD ⁺ ）相关的化合物，既有正相关也有负相关，表明了它们在发酵代谢网络中作为底物和产物的双重角色。

如图7所示，基于KEGG通路富集结果和相关文献，我们绘制了起泡苹果酒两个发酵阶段的潜在代谢网络。在发酵过程中，氨基酸、糖类、脂质和嘌呤代谢是主要的代谢途径。第一阶段的碳源和氮源主要来自苹果酒，其中葡萄糖通过糖酵解过程大量转化为丙酮酸，导致基础苹果酒中乳酸和丙氨酸的含量上升。糖类和氨基酸的转化促进了核苷的代谢，鸟嘌呤及其代谢产物黄嘌呤和鸟苷的水平上升，尿嘧啶转化为尿苷，腺嘌呤转化为次黄嘌呤和腺苷。

尽管在二次发酵前补充了蔗糖作为碳源，但其在早期阶段几乎被完全消耗。。应激发酵促进了Ehrlich途径的合成降解以及糖转化为高级醇的再合成，以及黄酮类化合物的合成转化。通过涉及苯丙氨酸和酪氨酸的苯丙烷代谢途径，对香豆酸转化为芹菜素、柚皮素和紫杉叶素，而邻香豆酸和4-羟基苯甲酸含量呈上升趋势。4-羟基苯甲酸的芳香环前体在辅酶Q的合成中起着重要作用，这对于维持线粒体呼吸电子传递链的正常工作至关重要。儿茶素、表儿茶素和原花青素在第一次发酵中的降解与二次发酵不同。

色氨酸是唯一含有吲哚结构的氨基酸，是一种人体必需的氨基酸，必须通过饮食摄取，并在代谢过程中转化为吲哚、维生素B6（又称吡哆醇）和烟酸。在第一次发酵期间，烟酸和烟酰胺代谢途径以及吲哚代谢途径都很活跃。NAD ⁺ 含量的增加暗示了色氨酸的从头合成途径、烟酰胺的挽救途径以及烟酸的Preiss-Handler途径可能在第一次正常的酵母发酵过程中存在。相比之下，在二次压力发酵过程中，烟酸和烟酰胺的含量并没有显著变化，尽管NAD ⁺ 含量保持稳定，这可能意味着色氨酸的从头合成途径在此过程中发挥了关键作用。此外，在第二次应激发酵期间，维生素B6的代谢途径变得活跃，其含量显著上调。吡啶酸是通过犬尿氨酸途径（kynurenine pathway,KP）的一个分支途径从色氨酸合成的，它具有广泛的神经保护、免疫和抗增殖作用。然而，吡啶酸只在第一次发酵后合成，并在二次发酵过程中被降解。

丝氨酸和甘氨酸的代谢过程，除了提供参与核苷酸及其衍生物合成的一碳单位外，还能与其他氨基酸相互作用产生其他活性成分。其中，甘氨酸与脯氨酸的环化作用生成环-L-脯氨酰甘氨酸，能减少早期凋亡细胞的数量，这可能是其保护效应的机制之一。由甘氨酸与谷氨酸和半胱氨酸反应生成的还原型谷胱甘肽具有抗氧化作用，能减少凋亡。在二次发酵过程中，硫胺代谢途径活跃，这可能解释了二次发酵后核苷酸和脂质的上调。硫胺的噻唑环和嘧啶部分由不同途径产生，其中噻唑环由酶Thi4通过甘氨酸、半胱氨酸和一个五碳糖合成，而嘧啶部分则由Thi5利用维生素B6和组氨酸产生。

3-脱氢肉碱是肉碱的一种中间代谢产物，与脂肪酸的β-氧化和赖氨酸的降解相关，主要在第一次发酵过程中产生，这表明在第一次发酵期间，以脂肪酸β-氧化为主导的活跃能量调节正在进行。相比之下，在第二次压力发酵过程中，更有可能发生短链脂肪酸的氧化和部分氧化脂肪酸的降解。此外，在二次发酵后挥发性异戊二烯类物质增加，这一过程需要大量消耗乙酰辅酶A、NADPH和ATP。这暗示了酿酒酵母在应激发酵期间的能量代谢是活跃的。在此发酵阶段，我们可以观察到参与海藻糖降解的糖酵解途径，促进了丙氨酸和缬氨酸的合成，应激发酵可能促进了乙偶姻向2,3-丁二醇的进一步转化。

总之，起泡苹果酒的风味形成受到两个发酵阶段的影响。第一次发酵基本上改变了苹果酒的组成，而二次发酵则增加了与苹果酒组成的差异，导致氨基酸和糖的总含量减少，以及脂质的积累。压力发酵促进了核苷和萜类物质的生产，并增加了挥发性化合物的含量，从而使起泡苹果酒的特征香气显著提升：如薰衣草醇、β-大马酮、醋酸和乙酸乙酯。此外， S. cerevisiae Y41在压力和乙醇的双重应激下，能够维持活跃的硫胺代谢、苯丙氨酸和酪氨酸代谢，并激活乙醇降解、海藻糖降解、激素合成、短链脂肪酸和氨基糖代谢等代谢途径，促使起泡苹果酒中的芹菜素、柚皮素、紫杉叶素、维生素B6、硫胺素、嘌呤和脂质含量增加。这些结果将帮助我们进一步理解不同发酵环境下 S. cerevisiae 的化学变化。本研究的结果为起泡苹果酒中代谢物形成机制提供了新的见解，不仅可能为起泡苹果酒发酵过程中的风味调控提供一些指导，而且为压力发酵调控酚类化合物和维生素产品的新研究思路和可能性提供了依据。