Science：上海交通大学团队结构生物学领域再登新高

无机磷酸盐（Pi）是生物体新陈代谢、信号转导途径、细胞结构和遗传物质组成的重要参与者。细胞内磷酸盐过多则会刺激细胞增殖和矿化，导致大脑和肾脏出现不良的血管钙化。人体内的磷酸盐水平受到严格调控，磷酸盐内流是由钠依赖性磷酸盐转运体家族成员介导的，目前只发现一种负责人类体内磷酸盐外排的磷酸盐转运蛋白，即 XPRl，其突变导致 Pi 外排受损会引发原发性家族性脑钙化。然而，XPR1 外排磷酸根以及其活性被 SPX 结构域调控的分子机制仍然未清楚。

2024 年 8 月 21 日，中国科学院物理研究所/北京凝聚态物理国家研究中心软物质与生物物理实验室姜道华团队在 Nature 期刊发表了题为 Human XPR1 structures reveal phosphate export mechanism 的研究论文。该研究利用冷冻电镜单颗粒技术重构磷酸盐转运蛋白 XPR1 处于不同构象的高分辨率结构，揭示了 XPR1 外排磷酸根离子的门控机制和 SPX 结构域的调控机制。

近期，XPR1 结构研究再登顶刊。上海交通大学医学院第九人民医院精准医学研究所曹禹团队与上海骨科移植重点实验室于烨团队合作，在 Science 期刊发表了题为 Structural basis for inositol pyrophosphate gating of thephosphate channel XPRl 的研究论文。研究展示了人 XPRl 在不同工作状态下的冷冻电镜结构，包括内向型、通道开放型和中间状态型。电生理学研究表明，XPRI 具有 PP-IPs 激活的磷酸盐通道转运功能。作者观察到 SPX 结构域在与 IPs/PP-IPs 接触时的构象变化，并提出了 PP-Ps 激活 Pi 外排的门控机制。

图 1 相关研究（图源： Science ）

图 2 人 XPRl 的阴离子电流和 hXPRl apo 的冷冻电镜结构（图源：[1]）

人 XPRl 的主体结构 本研究中人 XPRl 蛋白的高分辨率冷冻电镜解析结构（2.84 埃）由一个 N 端可溶性 SPX 结构域和一个跨膜螺旋束以及一个短的、无序的 C 端结构域组成。XPR1 N 端有一个保守的可溶性肌醇焦磷酸传感结构域（SPX）。SPX 结构域为跨膜螺旋束，通过监控细胞内磷酸盐浓度，调控 XPR1 蛋白外排活性，调节细胞磷酸盐平衡。XPRl 是人类中唯一含有 SPX 结构域的蛋白。SPX 在与肌醇磷酸盐（IP）和肌醇焦磷酸盐（PP-IP）结合时可改变其构象。

XPRl 跨膜结构域（TMDs）的特征是由多个环连接的两个跨膜螺旋（TMH1-10）和三个胞内螺旋，TMH5、6、9 和 10 有倾斜和扭曲，膜区中部出现断裂，三个非跨膜螺旋均位于 TMD 的细胞质一侧，二聚体界面由两个单体 TMH1 的疏水相互作用介导。

图 2. hXPRl 的闭合（内向）和通道开放形态（图源：[1]）

IPs 结合诱导的构象变化 补充 IPs 后，hXPRl 保持其二聚体结构。单体 A 在残基 W573 处的跨膜螺旋 9a 和 9b 之间出现断裂，导致 TMH9a 明显向外移位。比较 hXPRlapo  和 hXPRl-P，发现 TMH5b、6b、7-9 深入 hXPRl TMD，通过 TMH9a 和残基 W573 的倾斜形成一个内向腔，hXPRl-IP 结构中 TMH9a 和残基 W573 从其原来的位置移走，导致内向腔室缺失。

这些不同的封闭状态被命名为 hXPRl 和 hXPRlopen，前者的特征是存在内向腔室，后者的特征是形成跨膜通道。冷冻电镜颗粒分类显示了 hXPR1-Ps 复合物多种构象，包括同源二聚体、同源二聚体以及同时具有不同的封闭状态状态的不对称二聚体。这种构象异质性说明 hXPRl 和 IPs 之间存在相互作用，IPs/PP-IPs 诱导了磷酸盐传导通道的开启。

图 3. hXPR1-IP6/PPF 的全长结构（图源：[1]）

为减少加入 IPs 后的构象变化，作者在 hXPR1-IPs 样品中加入了抑制剂 PPF，并解析了全长结构 hXPR1IP/PPF。hXPRl-IPs/PPF 有 C-2 对称性，二聚体界面中心轴线垂直于膜平面。hXPR1-IPs/PPF TMD 向内腔室处有 PPF 的结合位点，W573 位点对 TMH9 的构象转变至关重要。底物结合位点上配位残基的点突变使得 IP 刺激的 Pi 外排明显降低，说明这些底物结合位点在介导 XPRl 有效 Pi 外排中发挥作用。

图 4. hXPR1 中 lP 的双重结合模式（图源：[1]）

在 hXPR1 的 SPX 结构域晶体结构中，两个 SPX 形成二聚体，其界面包括来自两个单体的螺旋 NH4 和 NH6。二聚化由 SPX 表面亚区域内的 IPs 分子桥接。配体的带负电荷的磷酸基团被带正电荷基团包围并与之发生静电作用。

突变分析阐明了这些相互作用的重要性。双突变体 R211A/R219A 削弱了 XPRl 中 IPs 介导的 Pi 外排。XPR1 界面正电残基之间的 IPs 桥突变体 R211E/R219E 在没有 IPs 的情况下表现出的 Pi 外排电流与野生型 XPRl 在 IPs 处理时相当，加入 IPs 则会增强 Pi 外排。取代这些带负电荷的酸性残基会促进 SPX 间形成接触，即使在没有 IP 的情况下，也能有效地模拟 IPs 对 XPRl 对立残基 Pi 流出的结合和激活效应。

肌醇焦磷酸盐结合界面肌醇焦磷酸盐是比 IP 更有效的含 SPX 蛋白的激活剂，为了解 PP-IP 的增强激活作用，作者用化学方法合成了肌醇焦磷酸，并解析了 XPR 结合 IP 的结构。TMD 和 SPX 两侧存在赖氨酸和组氨酸残基。TMD-SPX 表面位点之间的距离远长于 SPX 位点间，表明 TMD-SPX 位点更适合容纳 IP 和 IPs 中较大的焦磷酸基团。

hXPRl 开放和封闭构象分析揭示了膜上的磷酸盐渗透途径。开放构象的特点是亲水残基以正-负-正-负-正电荷模式排列，带正电荷的区域可能是磷酸盐结合位点。该通路还包括两个酸性间隔。对突变体进行电生理分析表明，即使没有 IPs、Pi 也会外排，残基 E600 起着 Pi 渗透闸门的作用。

图 5. hXPR1 的渗透途径（图源：[1]）

磷酸盐传导机制   根据添加功能分子的 hXPRl 所显示的 TMD 和 SPX 构象，作者提出了 IPs/PP-IPs 激活的 XPRl 磷酸盐传导机制。当细胞内 Pi 水平较低时，IPs/PP-IPs 结合的缺失会破坏 SPX 结构域的合并。当 Pi 水平升高时，IPs/PP-IPs 与 SPX 结合，引发 SPX 结构域向二聚化 C2 对称构型转变，从而进入 hXPRl 开放状态，促进磷酸盐的快速外排。PP-IPs 占据 TD-SPX 位点进一步稳定了 XPRl 对称构型，强化其 Pi 传导状态，促进 Pi 外排。

XPRl 介导 Pi 流入和流出，能对膜电位梯度的方向做出反应。由 IPs/PP-IPs 调节的门控机制确保 XPRl 在细胞内磷酸盐水平较低时保持关闭，从而防止磷酸盐流失。电导和调节机制使 XPRl 成为专用的磷酸盐输出通道，在功能上将其与其他两个亚家族的 Pi 转运体区分开来。XPRl 通道的门控与跨膜螺旋 9a 以及两个关键残基 W573 和 E600 动态密切相关，后者在控制 Pi 外排中起着更关键的作用。此外，在中心位点和细胞质入口之间有一个狭窄的、带负电荷的酸性区域，加强了 XPR1 对 Pi 外排的调控。在有 IPs 存在的情况下观察到更开放的构象，与 IP 处理后 Pi 外排增加相一致。

图 6. hXPR1-IP6/WO4 的中间构象（图源：[1]）

研究思路：通过确定人类 XPR1 在不同功能状态下与 Pi 底物结合的电子显微镜结构，揭示 XPR1 的结构特征和 Pi 运输机制。加入抑制剂 PPF 以减少加入 IPs 后的构象变化，并解析了 hXPR1IP/PPF 结构。解析 XPR 结合 IP 的结构以了解 PP-IP 的增强激活作用。结合功能诱变结果，阐明 Pi 结合、门控机制，以及感应与输出之间的耦合机制。

细胞内磷酸盐（Pi）的精确调节对细胞功能至关重要，XPRl 是人类最主要的 Pi 外排蛋白。由肌醇焦磷酸盐（PP-Ps）激活的 Pi 外排机制尚不清楚。本研究展示了多种形态的 XPRl 低温电子显微镜结构，揭示了  Pi 输出的跨膜途径和与 PP-Ps 的 双位点结合激活模式。一个典型结合位点位于 SPX 结构域的二聚体界面，第二个位点位于跨膜结构域和 SPX 结构域之间。通过将结构研究与电生理分析相结合，作者将 XPR1 确定为一个 IPs/PP-Ps 激活的磷酸通道蛋白。XPR1 的 TMD、SPX 结构域和 IPs/PP-Ps 之间的相互作用协调了其在封闭态和开放态之间的构象转换。

姜道华团队在 Nature 论文中的 IPs 结合 SPX-TMD 结构与本研究作者的 hXPR1-IP/PPF 结构在整体结构和 IPs 仅占据 SPX 位点的发现方面吻合，支持了作者 TMD-SPX 位点偏好 PP-IPs 的发现。这两项研究在开放和封闭构象以及 IPs 结合机制方面的一致发现，加上研究中显示的偏向 IPs/PP-IPs 结合位点和中间构象，提供了 XPR1 通道介导肌醇焦磷酸门控 Pi 外排的全面视角。综上，这两项研究推动了人磷酸盐转运蛋白结构机制的理解，为开发治疗和诊断分子工具奠定了基础。